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霍乱弧菌毒力基因zot的克隆表达及生物活性
目的 对霍乱弧菌zot毒力基因进行表达并研究重组蛋白的生物活性.方法 从霍乱弧菌(Vibrio cholerae)MO45中克隆zot的全基因序列,构建其原核表达质粒pET-32a(+)-zot并转化至大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中,通过诱导表达和亲和层析纯化重组蛋白,研究zot表达蛋白对人小肠上皮细胞的凋亡作用.结果 纯化蛋白的浓度为0.324 mg/mL,经Western blot验证表达蛋白为目的蛋白,用流武细胞仪检测经表达蛋白作用的人小肠上皮细胞显示重组zot蛋白能引起人小肠上皮细胞的早期凋亡.结论 成功克隆表达了霍乱弧菌毒力基因zot,重组蛋白能引起人小肠上皮细胞的早期凋亡.
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中国B.afzelii基因型莱姆病螺旋体GDsh1表面蛋白VlsE保守区段的克隆表达及抗原性分析
目的 克隆表达中国莱姆病螺旋体B.afzelii基因型菌株GDsh1的表面蛋白VlsE保守区段,并对其抗原性进行分析,为制备中国莱姆病重组抗原ELISA检测试剂盒提供依据.方法 结合文献,下载并比对PubMed上所有莱姆病螺旋体B.a型菌株的VlsE基因序列,确定保守区段,设计引物,扩增GDsh1的VlsE基因片段.将扩增产物与载体PET-32a连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.对重组载体进行序列测定,表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析.利用重组VlsE蛋白制备ELISA试剂盒,检测83份莱姆病阳性血清,90份阴性血清以及90份梅毒血清,计算重组试剂盒的灵敏度和特异性.并与科室已有的全菌蛋白ELISA试剂盒检测结果进行比较.结果 成功克隆表达了B.afzelii型VlsE保守区蛋白,West-ern blot结果显示VlsE保守区蛋白与免疫兔血清有较强的抗原抗体反应.ELISA结果表明:重组VlsE蛋白的灵敏度60.2％低于全菌蛋白的灵敏度92.8％ (P＜0.001);特异性分别为73.3％、68.9％,差异无统计学意义(P=0.511).在检测梅毒血清上特异性分别为83.3％、18.9％,重组蛋白的特异性远远高于全菌蛋白(P＜0.00l).结论 重组VlsE基因保守区段蛋白在莱姆病的检测中具有一定的灵敏度和特异性,且在区分梅毒血清与莱姆病血清上,其特异性远远高于全菌蛋白,在莱姆病血清学检测中具有不容忽视的重要意义.
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肺炎支原体P1黏附蛋白基因的克隆与表达
目的对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)3'端的P1黏附蛋白基因片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和表达产物的免疫性分析,为临床诊断试剂和疫苗的研制打下基础.方法应用PCR技术直接从Mp FH株染色体DNA中扩增894 bp的3'端p1基因片段(p1'),将此基因片段插入表达载体pGEX-6P-1后,转入大肠杆菌BL21扩增后提取重组质粒进行酶切、PCR扩增及核苷酸测序进行鉴定.诱导阳性克隆株表达重组蛋白后纯化,用兔抗Mp多克隆血清通过免疫印迹实验鉴定其免疫反应性.结果插入重组质粒的p1基因片段经测序后,与GenBank中p1基因核苷酸序列(AF290001、AF290002、AF286371、AE000002、M21519、M18639)比较,其同源性为99.66%～100%.氨基酸序列同源性为99.32%～100%.经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为59kDa.免疫印迹实验证实重组蛋白是P1黏附蛋白抗原.结论成功构建了pGEX-6P-1-p1'重组质粒并获得表达.此p1'基因重组质粒表达的蛋白具有免疫反应性,有希望成为特异性抗原诊断试剂和疫苗的候选抗原.
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猪囊尾蚴抗原cC1在巴斯德毕赤酵母中的表达
目的克隆并在巴斯德毕赤酵母中表达猪囊尾蚴抗原cC1.方法用PCR法在cC1cDNA5′端引入所需限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-cC1.采用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 PCR产物经测序无误,pPIC9-cC1和pPIC9k-cC1酶切分析与预期相符,获取863个酵母阳性重组克隆及9个高拷贝转化子.表达产物cC1的分子量约42kDa,占分泌总蛋白80%以上,产物浓度为200-350mg/L.Western blot证实表达产物具有天然cC1分子的免疫原性.结论在巴斯德毕赤酵母中成功表达了猪囊尾蚴cC1抗原,为进一步研究打下基础.
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空肠弯曲菌AhpC蛋白的克隆表达及抗原性分析
目的 构建空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶(ah pC)基因的原核表达系统,克隆表达AhpC蛋白,用Western blot以及ELISA方法检测表达蛋白的抗原性,为筛选空肠弯曲菌感染后特异性抗体检测试剂的制备奠定基础.方法 用PCR方法从中国分离菌株ICDCCJ07001的染色体DNA中扩增出ah pC基因,将目的基因插入表达载体pGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E.coliBL21( DE3),IPTG诱导重组质粒pG EX-ah pC的表达.SDS-PAGE分析表达产物,采用GST标签亲和层析柱纯化表达蛋白.应用兔免疫血清、临床感染者血清以及健康无感染者血清,利用Western blot以及ELISA的方法分析AhpC蛋白的抗原性并初步评价其在ELISA检测方法中的应用.结果 PCR扩增及双酶切鉴定证实重组质粒构建成功.重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为空肠弯曲菌AhpC蛋白,Western blot及ELISA检测结果显示AhpC具有特异抗原性.结论 成功构建了ah pC重组表达载体pGEX-4T-1/ahpC,并在大肠杆菌中高效表达.空肠弯曲菌AhpC蛋白具有抗原性,可以作为空肠弯曲菌感染后血清抗体检测的特异抗原.
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一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定
目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌B121(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测.结果 表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.
关键词： EC-SOD3-凋亡蛋白 克隆表达 纯化 噻唑蓝法 -
一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定
目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.
关键词： EC-SOD3-凋亡蛋白 克隆表达 纯化 噻唑蓝法 -
噬琼胶卵链菌β-琼胶酶基因YM01-5的克隆表达及其酶学性质的研究
目的 从青岛近海海水中分离鉴定了1株能够降解琼胶的海洋新菌—嗜琼胶卵链菌(Catenovulurna-garivorans gen.nov.sp.nov.)YM01T,并对其进行了全基因组测序.本文对该菌的1个β-琼胶酶基因YM01-5进行了克隆表达,并对重组琼胶酶的酶学性质进行了研究.方法 利用镍柱亲和层析对重组琼胶酶进行了分离纯化,采用DNS法测定重组酶的酶学性质,薄层层析(TLC)和质谱(MS)法对AgaYM01-5的酶解产物进行分析.结果 β-琼胶酶基因YM01-5全长2 412 bp,编码803个氨基酸,预测分子量为91.6 kD,其催化模块属于糖苷水解酶GH50家族.重组琼胶酶YM01-5酶学性质的研究结果表明,该酶的适温度为40℃,适pH为9.0.在35℃以下具有良好的热稳定性,pH 6～10之间保持较高的稳定性,在该范围的pH缓冲液中放置12 h后,YM01-5仍能保持80％以上的酶活力.此外,该重组琼胶酶降解琼脂糖的Km、Vmax值分别为15.6 mg/mL和188 U/mg,对降解产物的薄层层析及质谱分析结果表明,β-琼胶酶基因YM01-5以外切酶的形式作用于琼脂糖产生新琼二糖作为终产物.结论 该酶降解产物单一,有利于琼胶寡糖的制备,具有较高的工业应用潜力,它的发现也为研究菌株YM01中琼脂糖的代谢通路提供了参考.
关键词： β-琼胶酶YM01-5 克隆表达 酶学性质 新琼二糖 -
EHECO157:H7紧密粘附素胞外特异性片段(intiminC)的表达纯化及免疫检测的初步应用
目的:克隆表达并纯化肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7紧密粘附素胞外特异性片段(intiminC),摸索其免疫检测的初步应用.方法:设计引物采用PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增紧密粘附素胞外特异性片段的编码基因eaeC,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC,经测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测.目的蛋白经包涵体洗涤,使用含谷胱甘肽氧化还原系统的复性缓冲液进行稀释并结合透析复性后,再用阴离子交换柱Resource Q和分子筛柱Superdex 200进行纯化.将所得高纯度目的蛋白包被ELISA酶标板,对实验动物的免疫血清进行检测.结果:PCR法自EHEC O157:H7基因组扩增出了约570 bp的目的片段;原核表达质粒pET-21a(+)-eaeC经酶切及测序鉴定与设计序列-致.转化E coli BL21(DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约35%;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约20×103,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达.包涵体复性后目的蛋白纯化效果明显,高纯度的intiminC蛋白包被ELISA板,对实验室动物免疫血清的检测效果良好.结论:EHEC O157:H7紧密粘附素胞外特异性片段经基因克隆后获得了较好的表达,复性纯化后获得高纯度的目的蛋白intiminC,在此基础上建立的ELISA检测方法对实验室动物免疫血清的检测效果良好.为进-步的人血清抗体检测及EHEC O157:H7感染的流行病学研究奠定了基础.
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hTERT原核重组质粒的表达
目的本课题拟观察原核重组质粒pGEX-4T-1-hTERT在BL21细菌中的表达,为进一步探讨以hTERT为靶点的肿瘤基因免疫治疗提供实验依据.方法IPTG诱导带有pGEX-4T-1-hTERT质粒的BL21细菌融合蛋白的表达,取不同时间的培养物进行SDS-PAGE分析,并进行薄层凝胶光密度扫描测定目的蛋白表达量,同时对表达产物进行Western-blot检测.结果对SDS-PAGE结果分析发现,含pGEX-4T-1-hTERT质粒的BL21细菌能够表达出63kD的融合蛋白.薄层凝胶光密度扫描测定其表达水平高为28.4%,以IPTG诱导4 h表达量高.Western-blot检测表明该融合蛋白可被hTERT多抗识别.结论诱导pGEX-4T-1-hTERT重组质粒,获得分子量为63kD的GST-hTERT融合蛋白.用抗hTERT目的基因片段表达的相应抗原蛋白.
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MAGE-3原核重组表达载体的构建和表达
目的 构建原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的表达.方法 RT-PCR法制备MAGE-3目的基因,采用DNA重组技术将其克隆至pGEM-T Easy和亚克隆至pGEX-4T-1载体,转化E.coli BL21株,经IPTG诱导,12%SDS-PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定.结果 扩增出349bp的MAGE-3目的基因并构建了原核重组表达载体pGEX-4T-1- MAGE-3;测序结果与GenBank收录序列相一致;在E.coli BL21中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的蛋白.结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1- MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础,为后续实验提供了依据.
关键词： 逆转录-聚合酶链反应 黑色素瘤抗原-3 克隆表达 重组蛋白 -
鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0531融合蛋白原核表达载体的构建、表达及免疫原性检测
目的 构建鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci,Cps) CPSIT 0531原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,检测其免疫原性. 方法 采用PCR技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT_ 0531基因,并构建pET30a-CPSIT_ 0531原核表达载体,然后转化到宿主菌E.coli BL21中,IPTG诱导His-CPSIT_ 0531融合蛋白表达,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA分析His-CPSIT_ 0531蛋白的免疫原性. 结果 成功构建了pET30a-CPSIT_ 0531原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白;GST-CPSIT_ 0531免疫小鼠后,ELISA检测免疫小鼠的血清特异性抗体效价为1:640 000. 结论 成功克隆表达了His-CPSIT_ 0531,该蛋白具有较好的免疫原性.
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 CPSIT_0531 克隆表达 免疫原性 -
猪链球菌2型gdh基因的克隆与表达
目的 克隆表达猪链球菌2型诊断性抗原谷氨酸脱氢酶GDH. 方法 根据基因库中的gdh基因序列设计PCR引物,自病人分离株2007SF0165基因组扩增GDH的编码基因gdh,克隆至pMD19-T载体后进行测序分析,并且构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测. 结果 PCR法自猪链球菌2型菌株2007SF0165基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族Ⅰ的典型保守序列;构建筛选的原核重组表达质粒pGEX4T-2-gdh经诱导表达,获得蛋白相对分子质量为45 kDa目的蛋白. 结论 克隆并表达出猪链球菌2型诊断性抗原GDH,可为进一步研究奠定坚实的基础.
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自身免疫性肝炎新型抗原分子高迁移率族蛋白B1的克隆表达鉴定及蛋白纯化
目的 获得高纯度的人高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1),为制备单克隆抗体及研究其与自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)的关系打基础.方法 应用PCR从乳腺文库中扩增得到HMGB1基因片段,并将其克隆到pET28a(+)载体上,对获得的pET28a(+)-HMGB1重组质粒扩增后进行PCR、酶切和测序鉴定.将鉴定完全正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western blotting鉴定.后进行大量诱导并纯化,得到带His标签的HMGB1蛋白.结果 成功构建pET28a(+)-HMGB1重组质粒,并经诱导表达,得到了纯化的His-HMGB1蛋白.结论 构建pET28a(+)-HMGB1重组质粒并得到其表达蛋白,为今后深入研究HMGB1在AIH中的作用机理提供有力的实验工具.
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鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela细胞中的定位
目的构建鹦鹉热嗜衣原体( Cps) CPSIT_0018原核表达载体,表达并纯化该融合蛋白,观察其在感染的Hela细胞中的定位。方法采用PCR 技术从Cps 6BC基因组中扩增CPSIT_0018基因,并构建pET30a-CP-SIT_0018原核表达载体,然后转化到宿主菌 E. coli BL21中,IPTG 诱导His-CPSIT_0018融合蛋白表达,进一步用该融合蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,间接免疫荧光法分析His-CPSIT_0018蛋白在Hela细胞中的分布特征。结果成功构建了pET30a-CPSIT_0018原核表达载体,并表达和纯化较稳定的重组蛋白；在Cps感染的Hela细胞中CPSIT_0018的分布与主要外膜蛋白MOMP相似,而与包涵体膜蛋白IncA的分布模式不同。结论成功克隆表达了His-CPSIT_0018,该蛋白定位在Cps包涵体内。
关键词： 鹦鹉热嗜衣原体 CPSIT_0018 克隆表达 细胞定位 -
沙眼衣原体T细胞抗原CT143原核表达、纯化及免疫活性鉴定
目的 克隆沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)T细胞抗原Ct143基因,表达并纯化该蛋白,检测其免疫活性. 方法 采用PCR技术从Ct基因组中扩增Ct143基因,并构建pGEX-6p-Ct143原核表达质粒,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导重组GST-CT143融合蛋白表达,经酶切后得到无GST标签的纯蛋白免疫Balb/c鼠,ELISA及Western-blot分析CT143蛋白免疫原性及免疫反应性. 结果 成功构建了pGEX-6p-CT143原核表达质粒,序列测定证实重组质粒插入片段与GenBank登陆的Ct D型一致,长度为843 bp；GST-CT143融合蛋白在E.coli中获得稳定高效表达；纯蛋白与佐剂混匀后肌肉免疫小鼠,ELISA检测免疫小鼠的血清效价为1∶12 800,Western blot结果表明该蛋白与Ct泌尿生殖道感染病人混合血清中IgG结合,具有免疫反应性. 结论 成功克隆表达了CtT细胞抗原CT143,该抗原经纯化后具有良好的免疫原性及免疫反应性.
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MAGE-3目的基因原核表达载体的构建和表达
目的 构建原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3并检测其在大肠杆菌(E.coli)BL21中的表达,为制备以黑色素瘤抗原-3(MAGE-3)基因片段为基础的肽疫苗及特异诊断试剂提供抗原打下基础.方法 通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法制备MAGE-3目的基因,以pGEM-T Easy为克隆载体,pGEX-4T-1为原核表达载体,将MAGE-3目的基因克隆至pGEM-T Easy载体和亚克隆至pGEX-4T-1载体上.筛选、鉴定阳性克隆并将其转化E.coli BL21.经IPTG诱导,12%SDS-PAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定.结果 正确构建了原核重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-3;在E.co1i BL21中检测到含该重组表达质粒的转化菌表达出分子量35 kD的融合蛋白;基因测序结果表明,阳性克隆中的MAGE-3目的基因序列与GenBank公布的已知序列完全一致.结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX-4T-1-MAGE-3及其所表达的融合蛋白,为以MAGE-3目的基因为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础;为后续实验提供了依据.
关键词： 逆转录-聚合酶链反应 黑色素瘤抗原-3 克隆表达 重组蛋白 肿瘤免疫 -
INHA基因的克隆表达以及多克隆抗体的制备
目的 INHA的表达、纯化,以及多克隆抗体的制备.方法 利用基因重组技术获得INHA基因以及去信号肽的INHA基因,将其都分别构建到原核表达系统并分离纯化得到相对分子质量为58 000的带有组氨酸标签的重组INHA融合蛋白.用分离纯化后的INHA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHA的多克隆抗体.结果 成功地获得INHA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法 ,Western blot检测结果 显示,该抗体能特异性地与INHA的抗原以及胎盘组织产生明显免疫亲和反应.结论 建立原核高效稳定INHA表达系统,获得具有生物学活性的蛋白,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础.
关键词： INHA抗体 克隆表达 酶联免疫吸附反应 Western blot -
肠道病毒71型衣壳蛋白VP1基因部分序列在大肠杆菌中的表达
目的 克隆、表达和鉴定肠道病毒71型广州株EVGZ06VP1基因部分序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础.方法 在成功克隆肠道病毒71型广州株EVGZ06全长VP1蛋白基因并测序的基础上,将部分VP1蛋白基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建了重组表达质粒pET28a(+)/(502～891)VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法 检测其抗原性.结果 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量为19 000,与预计大小一致.ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性.结论 本研究成功克隆和表达了肠道病毒71型VP1基因部分序列,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础.
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幽门螺杆菌基因hp0231和hp0410的克隆表达及生物信息学分析
目的 获取幽门螺杆菌hp0231和hp0410基因的序列,预测其编码蛋白HP0231和HP0410作为候选疫苗的可行性,在大肠杆菌表达系统中表达hp0231和hp0410.方法 提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA,按照GenBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR,扩增hp0231和hp0410基因,克隆入pMD18-T载体中测序,进行生物信息学分析.将hp0231和hp0410克隆入表达载体pGEX-4T-1中,诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定.结果 生物信息学分析表明HP0231和HP0410均为外膜蛋白,具良好的抗原性,并且与其他生物的同源性较低,其作为Hp疫苗不易产生交叉反应以及自身免疫性反应,构建的重组菌可高水平表达可溶性重组蛋白.结论 HP0231和HP0410是有良好应用前景的Hp候选疫苗.
关键词： hp0231和hp0410基因 幽门螺杆菌 克隆表达 生物信息学分析
