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肺炎支原体P1黏附蛋白的表达及初步应用研究
目的 对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)3 '端的P1黏附蛋白基因片段进行密码子优化与重组表达、蛋白纯化、表达产物的免疫性分析及临床诊断初步应用研究.方法 选择Mp FH株P1蛋白序列优化并合成933 bp的3'端p1反义基因片段(p1 '),将此基因片段插入表达载体pET-GST后,转入大肠杆菌BL21.诱导阳性克隆株表达重组蛋白后,纯化该蛋白质,用肺炎支原体感染阳性患者,血清通过免疫印迹实验鉴定其免疫反应性.结果 诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为59kDa.免疫印迹实验证实重组蛋白P1可与阳性肺炎支原体感染患儿血清发生特异性反应,用P1蛋白建立的间接ELISA法,其敏感性和特异性分别为95.5％和95.45％.结论 已成功地在大肠杆菌中表达了P1蛋白,为MP感染的快速诊断提供了一种新的方法,也为进一步探讨P1蛋白的功能及其在MP感染发病机制中的作用奠定了基础.
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肺炎支原体P1黏附蛋白基因的克隆与表达
目的对肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)3'端的P1黏附蛋白基因片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和表达产物的免疫性分析,为临床诊断试剂和疫苗的研制打下基础.方法应用PCR技术直接从Mp FH株染色体DNA中扩增894 bp的3'端p1基因片段(p1'),将此基因片段插入表达载体pGEX-6P-1后,转入大肠杆菌BL21扩增后提取重组质粒进行酶切、PCR扩增及核苷酸测序进行鉴定.诱导阳性克隆株表达重组蛋白后纯化,用兔抗Mp多克隆血清通过免疫印迹实验鉴定其免疫反应性.结果插入重组质粒的p1基因片段经测序后,与GenBank中p1基因核苷酸序列(AF290001、AF290002、AF286371、AE000002、M21519、M18639)比较,其同源性为99.66%～100%.氨基酸序列同源性为99.32%～100%.经SDS-PAGE分析,重组蛋白的相对分子量约为59kDa.免疫印迹实验证实重组蛋白是P1黏附蛋白抗原.结论成功构建了pGEX-6P-1-p1'重组质粒并获得表达.此p1'基因重组质粒表达的蛋白具有免疫反应性,有希望成为特异性抗原诊断试剂和疫苗的候选抗原.
