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北京发现ST4821克隆群B群脑膜炎奈瑟菌
目的 对2013年1月北京市1例流行性脑脊髓膜炎(流脑)死亡病例标本进行脑膜炎奈瑟菌检测,了解感染病原及分离菌株的分子流行病学特征.方法 对患者脑脊液标本进行细菌分离培养,通过常规细菌学试验对分离菌株进行脑膜炎奈瑟菌鉴定、实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative PCR)方法检测患者脑脊液和抗凝血中脑膜炎奈瑟菌核酸,同时对鉴定的菌株进行多位点序列分型(MLST)分析、外膜蛋白PorA分型和FetA分型,以及体外药物敏感试验.结果 从患者脑脊液和抗凝血标本中均检测到脑膜炎奈瑟菌种特异基因ctrA和血清群B特异基因siaD.从患者脑脊液中分离到1株可疑阳性菌,经实验确诊为B群脑膜炎奈瑟菌.PorA为P1.20,23-9,FetA为F1-91;多位点序列分型分析显示基因型为ST10051,属于ST4821序列群.该菌株对复方新诺明为中等耐药,对环丙沙星和四环素耐药,对青霉素、头孢噻肟、头孢曲松、左氧氟沙星、美罗培南、氯霉素、利福平等药物均敏感.从密切接触者咽拭子中未分离到脑膜炎奈瑟菌.结论 该菌株经鉴定为B:P1.20,23-9:F1-91:ST10051(ST4821序列群).北京地区人群中已经存在高致病性ST4821克隆群B群脑膜炎奈瑟菌,并引发死亡病例,提示应全面掌握本地区脑膜炎奈瑟菌健康人群携带情况及病例菌株分子流行病学资料,为流脑的预防控制提供实验室数据支撑.
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以重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP为载体的结合疫苗制备及免疫原性研究
目的:以重组B群脑膜炎奈瑟菌(Nesseria meningitidis,Nm)外膜蛋白fHBP(recombinant factor H binding protein,rfHBP)为载体与C群多糖(group C meningococcal polysaccharide,GCMP)共价结合制备结合疫苗并免疫小鼠,检测小鼠血清中针对B群和C群Nm的杀菌抗体,评价该重组蛋白作为结合疫苗载体的可行性及该结合疫苗对B群Nm的交叉保护性.方法:扩增fhbp并连接到pET30a(+)表达载体上,转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍亲和层析柱纯化rfHBP,CNBr活化法将rfHBP与GCMP共价结合,制备结合疫苗,免疫小鼠,间接ELISA法检测血清中GCMP抗体和rfHBP抗体滴度,TTC法检测结合物诱导的分别针对B群和C群Nm的杀菌抗体水平.结果:成功扩增fhbp并连接至pET30a(+)表达载体上,大肠杆菌中诱导表达rfHBP,纯化后与GCMP结合.结合物免疫小鼠后,检测到的针对GCMP的IgG抗体滴度与GCMP组比较有明显加强效应；三针免疫后,针对C群Nm的杀菌抗体滴度高于GCMP对照组,有统计学意义(P＜0.05)；针对B群Nm的杀菌抗体滴度与rfHBP对照组间无统计学意义(P＞0.05)；两组结合物诱导的分别针对B群Nm CMCC29361株和ATCC700111株的杀菌抗体滴度间无统计学意义(P＞0.05).结论:结合疫苗免疫小鼠后检测到的针对C群Nm的杀菌抗体高于单独GCMP组,证明该重组蛋白可作为结合疫苗的载体蛋白；且在结合过程中较好地保留了蛋白的免疫原性,对B群Nm有良好的交叉保护作用.
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湖南省B群脑膜炎奈瑟菌药物敏感性及分型
近年来,湖南省流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)流行以C群脑膜炎奈瑟菌(Nm)为主[1],2009年2月,首次从流脑患者身上分离出B群脑膜炎奈瑟菌,2010年在健康人群流脑咽拭子中,同时分离到4株B群脑膜炎奈瑟菌.为掌握湖南省B群脑膜炎奈瑟菌的分子生物学特征,为有效的预防和控制其流行提供依据,本研究采用传统检验方法和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、脉冲场凝胶电泳(pulsedfield gel electrophoresis,PFGE)等方法对上述B群流脑奈瑟菌分离株进行了鉴定和分型分析.现将结果报告如下.
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B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究
目的:构建B群脑膜炎奈瑟菌pcDNA3.1 (+)/NMB0315 真核表达重组质粒,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供实验依据. 方法:以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pcDNA3.1 (+)真核表达载体中,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒.构建成功的pcDNA3.1(+)/NMB0315重组质粒转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,免疫细胞化学染色法和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达. 大量提取重组质粒,肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内抗NMB0315的特异性体液免疫和细胞免疫水平;测定免疫血清体外杀菌滴度,观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果. 结果:构建的核酸疫苗pcDNA3.1 (+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达;免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答. 在疫苗免疫后的2、4、6周,pcDNA3.1(+)/NMB0315组和pcDNA3.1(+)/NMB0315+CpG组血清总IgG及IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3亚类抗体水平呈递增趋势,均明显高于PBS、pcDNA3.1(+)、CpG对照组(P<0.001);小鼠血清IgG2a/IgG1比值均小于1;生殖道灌洗液中特异性sIgA水平均明显高于PBS、pcDNA3.1(+)、CpG对照组(P<0.01). 免疫第6周,脾淋巴细胞刺激指数(SI)均明显高于对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.05). pcDNA3.1(+)/NMB0315+CpG、pcDNA3.1(+)/NMB0315 疫苗组免疫血清补体介导的体外杀菌效价分别为1:128和1:64;在致死量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72 h存活率分别为70%和65%,对照组[PBS,pcDNA3.1(+),CpG]72 h存活率为0. 结论:NMB0315核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫(包括黏膜免疫)和细胞免疫应答;免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高;NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的免疫保护作用.
关键词： B群脑膜炎奈瑟菌 B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315 核酸疫苗 免疫活性 免疫保护 -
不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白表达的影响
目的 探讨不同信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌H因子结合蛋白(factor H-binding protein,fHBP)表达的影响.方法 运用PCR方法将B群脑膜炎奈瑟菌fHBP原始信号肽分别替换为大肠埃希菌主要外膜脂蛋白(major outer membrane lipoprotein,MLP)、脂蛋白-28(lipoprotein-28,LP)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)P4外膜蛋白信号肽,并将其分别连接至pET-30a表达载体,转化入大肠埃希菌感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定蛋白表达水平.结果 替换了P4、LP和MLP信号肽的重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP表达量较带原始信号肽的B群脑膜炎奈瑟菌fHBP相比,分别提高了2.68、1.94和2.91倍.结论 替换MLP信号肽对重组B群脑膜炎奈瑟菌fHBP蛋白表达的影响大,为提高B群脑膜炎奈瑟菌fHBP表达量的研究工作提供了新思路.
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2株B群脑膜炎奈瑟菌的分子生物学分析
[目的]探讨分离自大连市开发区2005年和2008年外来人口中2例暴发型脑膜炎死亡病例2株B群脑膜炎奈瑟菌的分子生物学特征及其关联性.[方法]2010年,对2株B群流脑菌株进行脉冲场电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)分型分析.[结果]2株菌PFGE型相似性为100%,应为同一来源;MLST分析结果均为ST5662型.菌株对青霉素、头孢类、阿齐霉素、氯霉素、利福平等多种抗菌药物敏感.[结论]2株B群脑膜炎奈瑟菌分子分型结果一致,为同一科隆.
关键词： B群脑膜炎奈瑟菌 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 多位点序列分析 -
1例由B群脑膜炎奈瑟菌引起的新生儿脑膜炎的调查
目的 为明确诊断1例新生儿B群脑膜炎奈瑟菌引起的流行性脑脊髓膜炎.方法 对1例新生儿疑似流脑病例进行流行病学调查.收集病例的临床标本及其密切接触者相关的咽拭标本进行脑膜炎奈瑟菌的分离培养.结果 患儿的脑脊液和其父亲咽试子标本中均分离到B群脑膜炎奈瑟菌菌株,且2株菌株对9种抗生素的药敏结果完全一致.结论 结合该病例的临床流行病学资料及相关的实验室检测结果,该患儿是B群脑膜炎奈瑟菌引起的病例.
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1例罕见的新生儿B群流脑死亡病例的实验室结果分析
目的 明确诊断并分析l例新生儿疑似流行性脑膜炎死亡病例可能的传染来源和传播途径.方法 收集死亡病例的血液标本及其密切接触者的咽试子标本并进行菌株的分离培养和分型及药敏试验.结果 死亡病例的血标本及其密切接触者患儿父亲咽试子标本均分离到B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株菌株对氨苄西林、环丙沙星、利福平、氯霉素、头孢噻吩、红霉素及四环素均敏感,对磺胺类药耐药.结论 根据该病例的特点和实验室检测结果,判断该病例为B群脑膜炎奈瑟菌引起的死亡病例.
关键词： B群脑膜炎奈瑟菌 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 密切接触者 细菌培养 PCR -
海南省首例B群流行性脑脊髓膜炎病例病原学分析
目的 对海南省海口市2015年2月发现的1例新生儿B群流行性脑脊髓膜炎(流脑)病例进行病原学分析.方法 采集新生儿血液接种于血培养瓶,对培养出的菌株采用生化鉴定、血清学分型和普通聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术鉴定、基因分型;分离株进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)及14种抗生素敏感性试验.结果 从新生儿血液中培养出的菌株经生化鉴定、血清学分型与PCR技术鉴定、基因分型结果一致,均是B群脑膜炎奈瑟菌.该菌株MLST结果为序列型ST-7962,属无序列群分类.该菌株对青霉素、氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、美罗培南、氯霉素、阿奇霉素、米诺环素、利福平敏感,对左氧氟沙星中介,对复方新诺明、磺胺、环丙沙星、萘啶酸耐药.结论 海南省发现新生儿感染B群脑膜炎奈瑟菌病例,应加强病原菌监测与研究,以便采取针对性的防控措施,合理使用抗生素.
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脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的免疫效果
目的 研究原核重组表达的B群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白0315(rNMB0315)在诱导小鼠产生特异性免疫应答中的作用、免疫血清抗体体外杀菌活性和重组蛋白的免疫保护效果,初步评价rNMB0315作为B群流脑疫苗候选抗原的潜力.方法 将构建的原核表达载体pET30a-NMB0315转化大肠杆菌BL21表达重组蛋白,纯化鉴定后的重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,检测体液免疫和细胞免疫水平;测定血清抗体在补体介导下的体外杀菌活性,观察rNMB0315蛋白疫苗对实验小鼠的免疫保护效果.结果 rNMB0315具有良好的免疫原性,能诱导产生较高水平的体液免疫应答:包括血清特异性IgG、IgG1、IgG2a、IgG3、IgG2b和生殖道黏膜特异性分泌型IgA (sIgA),免疫后第6周抗体效价分别为1∶150 000、1∶85 000、1∶60 000、1∶35 000、1∶30 000和1∶30 000;也能激发较高水平的细胞免疫应答,免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应的刺激指数(SI)值明显高于PBS、Freund佐剂对照组.在免疫的2、4、6周,血清IgG2a/IgG1比值均小于1,提示rNMB0315疫苗以诱导Th2细胞性体液免疫应答为主.rNMB0315疫苗免疫血清在补体介导下的体外杀菌抗体效价为1∶128;72 h内,对实验小鼠的免疫保护率为90％.结论 原核表达的rNMB0315具有良好的免疫活性和免疫保护效果,NMB0315外膜蛋白具有作为预防B群流脑蛋白疫苗候选抗原的潜力.
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PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株
目的 用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定.方法 用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶siaD基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与GeneBank 中原始siaD序列比对. 结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始siaD序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌siaD原始基因序列同源性分别为98%和99%. 结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株.
