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多环芳烃与p16、FHIT基因CpG岛甲基化在宫颈上皮内瘤变中的交互效应
目的 探讨多环芳烃与p16、FHIT基因CpG岛甲基化在宫颈上皮内瘤变(CIN)中的作用及其交互效应.方法 利用2014年6--12月建立的山西省阳曲县宫颈病变研究队列.包括经病理学确诊的CIN患者169例(CIN Ⅰ 86例,CINⅡ/Ⅲ83例)和正常宫颈(NC)妇女91例.全部研究对象采用高效液相色谱法检测尿液中的1-羟基芘(1-OHP)浓度,甲基化特异性PCR法检测抑癌基因p16、FHIT CpG岛甲基化状态.应用SPSS 20.0软件进行相关资料的Kruskal-Wallis H检验、x2检验、趋势x2检验,应用logistic回归模型计算因素与宫颈疾病之间关联强度的OR值及其95％CI,应用广义多因子降维模型(GMDR)评价交互作用.结果 随着CIN程度加重,l-OHP水平逐渐上升(H=50.743,P＜0.001),1-OHP高暴露率逐渐升高(趋势检验x2=20.146,P＜0.001).CIN Ⅰ、CINⅡ/Ⅲ组p16、FHIT CpG岛甲基化率均高于NC组;随着C1N程度的加重,p16基因CpG岛甲基化率(趋势检验x2=9.75,P=0.002)、FHIT基因CpG岛甲基化率(趋势检验x2=10.39,P=0.001)均逐渐升高.GMDR交互作用分析显示,在CIN Ⅰ和CINⅡ/Ⅲ组,1-OHP高暴露与p16、FHIT基因CpG岛甲基化呈交互作用.结论 l-OHP高暴露和p16、FHIT CpG岛甲基化均可增加CIN的风险,且在病变中具有协同作用.
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儿童青少年肥胖与DNA甲基化关联研究进展
DNA甲基化是目前研究常见的表观遗传现象,有助于从生物学机制上解释遗传因素、环境因素及基因-环境因素交互作用对于肥胖的影响.生命早期DNA甲基化研究对于预防和控制肥胖具有重要作用,国内此方面研究尚缺乏.本研究通过回顾儿童青少年肥胖与DNA甲基化关联研究现状,介绍DNA甲基化研究的主要原理、基本特点及其与肥胖关联研究的主要结果,为今后相关研究提供依据.
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外周血全基因组DNA甲基化在甲基供体与乳腺癌关系中作用的研究
目的 探讨外周血全基因组DNA甲基化在甲基供体(叶酸、蛋氨酸、总胆碱、甜菜碱)与乳腺癌发病关系中的作用.方法 采用病例对照研究设计,共纳入300例乳腺癌病例和300例对照.采用食物频数问卷调查研究对象的膳食摄入并计算甲基供体的摄入量.采集研究对象外周血提取DNA,使用MethylFlashTMMethylated DNA Quantification Kit (Colorimetric)进行全基因组DNA甲基化分析.运用路径分析表现甲基供体摄人、全基因组DNA甲基化程度和乳腺癌发病之间的相互关系.结果 病例组和对照组外周血全基因组DNA甲基化率分别为0.46％±0.25％和0.53％±0.34％,病例组低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).路径分析结果显示,蛋氨酸摄入与外周血全基因组DNA甲基化程度呈正相关(β=0.065,P＜0.05),而外周血全基因组DNA甲基化程度与乳腺癌发病风险呈负相关(β=-0.027,P＜0.05).结论 乳腺癌病例外周血全基因组DNA甲基化程度低于对照组人群.外周血全基因组DNA甲基化在蛋氨酸摄入与乳腺癌发病风险之间起了中介作用.
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环氧化酶-2基因启动子甲基化及表达与胃黏膜病变的关系
目的 探讨环氧化酶2(COX-2)基因启动子区甲基化水平和蛋白表达与胃黏膜病变的关系,并对其相关的影响因素进行研究.方法 以1201例患有不同胃黏膜病变的高危人群为研究对象,采用免疫组织化学方法榆测COX-2表达,用亚硫酸氢钠-变性高效液相色谱(DHPLC)对COX-2启动子甲基化率进行定量分析,采用13C尿素呼气实验(13C-UBT)对幽门螺旋杆菌(H priori)感染状况进行测定.结果 COX-2甲基化率中位数随胃黏膜病变的加重逐渐升高,在浅表性胃炎和慢性萎缩性胃炎(SG/CAG)、肠上皮化生(IM)及不确定性异型增生和异璎增生(Ind DYS/DYS)病变中分别为10.6%、11.8%、13.8%,各病变组之间差异有统计学意义(X2=8.312,P=0.016).分层分析显示,在H pylori感染阴性病例中,COX-2甲基化率仍随病变加重明显升高,在SG/CAG、IM、Ind DYS/DYS病变中其中位数分别为8.8%、10.6%、14.1%(X2=6.629,P=0.036).进一步分析发现,COX-2甲基化率随着COX-2表达强度的增强而降低,由COX-2弱阳性表达的13.3%降至强阳性表达的7.6%(X2=10.400,P=0.015).结论 COX-2启动子甲基化水平与胃黏膜病变程度及H pylori感染状况密切相关,并与COX-2表达强度呈负相关,说明COX-2启动子区异常甲基化可能在胃黏膜病变的演变过程中起重要作用.
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结晶型硫化镍诱发细胞恶性转化过程中基因组总体DNA甲基化的改变
目的 探讨结晶型硫化镍(NiS)对体外培养细胞基因组总体DNA甲基化水平的影响.方法 分别以0.25、0.50、1.00、2.00 μg/cm2结晶型NiS处理人支气管上皮细胞系(16HBE)24 h,隔天再次进行相同处理,共处理3次;以3μmol/L DNA甲基化转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷(DAC)处理72 h的正常细胞为阳性对照.应用免疫荧光法和SssI甲基转移酶法定性、定量分析结晶型NiS处理细胞和恶性转化细胞(NSTC)基因组DNA总体甲基化的变化.结果 结晶型NiS处理细胞DNA甲基化免疫荧光的强度均有不同程度降低,转化细胞DNA甲基化免疫荧光的强度明显降低.定量分析结果显示,对照组基因组总体甲基化率(mCpG%)为(81.9±7.3)%,0.25、0.50、1.00、2.00 μg/cm2的结晶型NiS处理3次的细胞(NiS0.25、NiS0.50、NiS1.00、NiS2.00)基因组总体mCpG%则分别为(77.9±6.2)%、(75.3±6.8)%、(59.5±4.9)%、(67.4±5.1)%.经单因素方差分析显示,不同组间总体mCpG%差异有统计学意义(F=124.95,P＜0.01),两两比较发现NiS1.00和NiS2.00组与对照组相比,差异均有统计学意义(t值分别为7.64、4.89,P值均＜0.01);恶性转化细胞(NSTC1、NSTC2)基因组总体mCpG%分别为(46.2 ±4.1)%、(43.6±4.3)%,低于对照组,差异有统计学意义(t值分别为12.79、13.56,P值均＜0.01).结论 结晶型NiS诱发细胞恶性转化过程中,整体基因组DNA甲基化水平降低.
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贵州兴仁县燃煤型砷中毒患者p16基因甲基化研究
目的 了解抑癌基因p16启动子区CPG岛在燃煤型砷中毒患者中甲基化的情况和意义.方法 分别采集燃煤型砷中毒患者与正常人群外周血标本各51例和52例,采用酚-氯仿法提取DNA.紫外分光光度法测定DNA的含量,将基因组DNA变性成为单链,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA,所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变.设计针对甲基化和非甲基化等位基因的特异引物,进行巢式PCR扩增,后经凝胶电泳检测目的片段.结果 燃煤型砷中毒患者与正常对照p16基因启动子区CPG岛甲基化检出率分别为94.1%(48/51)和71.1%(37/52),两者间差异有统计学意义.结论 p16启动子区CPG岛甲基化与燃煤型砷中毒有关联.
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柴油机尾气暴露人群乙烯基DNA加合物与DNA甲基化水平的关系研究
目的 探讨柴油机尾气(DEE)暴露人群乙烯基DNA加合物与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A基因(P16)、Ras相关结构域家族1A基因(RASSF1A)和O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶基因(MGMT)启动子区DNA甲基化水平的关联性.方法 采用整群抽样法于2012年选取河南省某柴油机厂124名车间试车工人为DEE暴露组,选取同地区自来水厂112名非DEE暴露工人为对照组.收集研究对象的人口学信息,并采集静脉血和班后尿液.应用高效液相色谱-质谱联用方法检测研究对象尿液中乙烯基DNA加合物的生成情况,包括N6-亚乙烯基-2'-脱氧腺苷(εdA)和3,N4-亚乙烯基-2'-脱氧胞苷(εdC).运用焦磷酸测序方法分析P16、RASSF1A和MGMT启动子区DNA甲基化水平,以5-甲基胞嘧啶(5mC)占胞嘧啶的百分比表示(%5mC).采用Spearman相关分析和多重线性回归分析乙烯基DNA加合物和DNA甲基化水平的关系.结果 暴露组和对照组工人尿液中 εdA浓度的P50(P25~P75)分别为230.00(98.04~470.91)、102.10(49.95~194.48)pmol/g肌酐,暴露组高于对照组(P<0.001).暴露组工人P16、RASSF1A和MGMT启动子区DNA甲基化水平分别为2.04±0.41、2.19(1.94~2.51)和2.22(1.94~2.46)%5mC,对照组工人分别为2.19±0.40、2.41(2.11~2.67)和2.44(2.15~2.91)%5mC,暴露组低于对照组(P值分别为0.005,0.002和<0.001).Spearman相关分析显示,P16、RASSF1A和MGMT启动子区DNA甲基化水平与尿液中εdA浓度呈负相关(r值分别为-0.155、-0.137和-0.198,P值均<0.05),与εdC浓度相关无统计学意义(P>0.05).多重线性回归分析显示,在非吸烟人群中,εdA与P16、RASSF1A和MGMT启动子区DNA甲基化负相关[β(95%CI)值分别为-0.068(-0.132~-0.003)、-0.082(-0.159~-0.004)和-0.048(-0.090~-0.007),P值分别为0.039,0.039和0.024],εdC与MGMT启动子区DNA甲基化负相关[β(95%CI)值为-0.094(-0.179~-0.008),P=0.032].结论 DEE暴露可引起εdA升高,P16、RASSF1A和MGMT启动子区DNA甲基化水平降低.
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A激酶锚定蛋白12基因甲基化与原发性肝癌复发的关系研究
目的 探讨A激酶锚定蛋白12(AKAP12)甲基化与原发性肝癌复发的关系.方法 于2003—2009年,以在北京大学肿瘤医院肝胆外科接受手术治疗的原发性肝癌患者作为研究对象,对其进行≥3年的随访.纳入标准:肝细胞癌患者,经鉴定切缘组织无肿瘤细胞存在;手术时无淋巴结转移及远处转移;有完整的临床资料,共142例.截至2014年5月随访结束,共有75例研究对象复发,其中71例死亡,无失访.从冰冻手术标本中获取研究对象的肿瘤组织及切缘组织,采用酚-氯仿法提取DNA并修饰后进行PCR扩增,对PCR产物进行克隆并测序分析,应用变性高效液相色谱检测研究对象肿瘤组织和肿瘤旁切缘正常组织AKAP12基因的甲基化状态.采用Log-rank检验对研究对象生存时间进行单因素分析;采用多因素Cox比例风险模型分析研究对象生存时间差异的影响因素.结果 142例研究对象中,男性125例(88.0％),年龄为34～76岁,中位年龄是52.5岁.肿瘤组织中AKAP12甲基化阳性率(54.9％,78/142)高于切缘组织中AKAP12甲基化阳性率(10.2％,6/59).与AKAP12甲基化阴性者相比,AKAP12甲基化阳性者原发性肝癌复发风险较低HR=0.62,95％CI:0.39～0.99;与肿瘤直径≤5 cm者相比,肿瘤直径>5 cm者原发性肝癌复发风险较高HR=1.53,95％CI:1.00～2.50;与无门脉侵犯者相比,有门脉侵犯者原发性肝癌复发风险较高HR=4.53,95％CI:2.69～7.64.与无门脉侵犯者相比,有门脉侵犯者死亡风险较高HR=2.98,95％CI:1.73～4.98.结论 AKAP12甲基化与原发性肝癌的复发及无疾病生存时间相关.
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DNA甲基化与肥胖相关性的孟德尔随机化研究
目的 利用孟德尔随机化方法,探索DNA甲基化位点与肥胖的相关性.方法 2013年以中国双生子登记系统中山东、江苏、浙江和四川招募的双生子人群中≥18岁的肥胖状况不一致的双生子作为本次调查对象,共469名.通过问卷调查、体格检查及血样采集,收集双生子的一般信息、行为信息及体格信息,并提取外周血DNA进行相关基因型测定及全基因组甲基化检测.并分析了全基因组DNA甲基化与BMI的关联以及CpGs与邻近SNP的关联.利用孟德尔随机化方法,以SNP位点rs748212作为工具,分析肥胖指标BMI与cg15053022甲基化的关系.结果 研究共纳入469名调查对象,年龄为(44.8±13.2)岁,BMI为(25.0±3.8)kg/m2.全基因组DNA甲基化与BMI的关联分析发现,有9个CpG位点甲基化水平与BMI存在关联.在进行CpGs甲基化与邻近SNP的关联分析发现,ATP4A基因的cg15053022与rs748212呈负相关(β=-0.020),rs748212AA、AC、CC基因型的cg15053022甲基化水平分别为0.212±0.025、0.242±0.024、0.264±0.028.孟德尔随机化分析发现,rs748212与BMI存在关联(β=0.04,P=0.007),且与ATP4A基因的cg15053022关联强度较高(F=237.66,P=0.143).孟德尔随机化结果显示,cg15053022甲基化水平每降低10%,BMI增加0.197 kg/m2(β=-1.97,P<0.001).结论 本研究利用孟德尔随机化的方法发现观察性研究中ATP4A基因上的甲基化位点cg15053022甲基化能够影响BMI,为肥胖甲基化孟德尔随机化相关研究的方法学提供了参考依据.
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聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在苯并(a)芘诱导人支气管上皮细胞DNA甲基化改变中的作用
目的 观察苯并(a)芘[benzo(a)pyrene,B(a)P]诱导体外细胞DNA甲基化水平改变,探讨聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]在该过程中的作用.方法 以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0 μmol/L浓度B(a)P分别处理人支气管上皮细胞(16HBE)及其PARP1缺陷细胞(16HBE-shPARP1)72 h.采用免疫荧光和高效毛细管电泳检测其基因组DNA整体甲基化水平改变,同时动态监测PARP1和DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferases 1,DNMT1)表达的变化.结果 16HBE和16HBE-shPARP1细胞基因组整体甲基化百分比(mCpG%)分别为(4.04±0.08)%和(9.69±0.50)%.经5-氮杂脱氧胞苷(DAC)处理72 h后,mCpG%值分别下降为(3.15±0.14)%、(6.07±0.54)%.经B(a)P染毒72 h后,16HBE细胞基因组mCpG%值[B(a)P浓度由低到高]分别为(5.10±0.13)、(4.25±0.10)、(3.91±0.10)、(4.23±0.27)、(3.70±0.15)、(3.08±0.07);16HBE-shPARP1细胞基因组mCpG%值(浓度由低到高)分别为(10.63±0.60)、(13.08±0.68)、(9.75±0.55)、(7.32±0.67)、(6.90±0.49)、(6.27±0.21).两种细胞不同处理组间mCpG%差异有统计学意义(F值分别为61.67、60.91,P值均＜0.01).16HBE细胞各剂量组[B(a)P浓度由低到高]PARP1基因mRNA相对表达水平分别为对照组的141.0%、158.0%、167.0%、239.0%、149.0%、82.9%,差异均有统计学意义(t值分别为11.45、17.32、32.24、33.44、20.21、9.87,P值均＜0.01);16HBE-shPARP1细胞各剂量组(浓度由低到高)PARP1基因mRNA相对表达水平分别为对照组的169.0%、217.0%、259.0%、323.0%、321.0%、256.0%,差异有统计学意义(t值分别为9.06、15.92、22.68、26.23、37.19、21.15,P值均＜0.01).当B(a)P染毒剂量达5.0 μmol/L后,16HBE细胞各剂量组(浓度由低到高)DNMT1基因mRNA相对表达水平分别为对照组的125.0%、162.0%、275.0%、233.0%,差异有统计学意义(t值分别为12.74、24.92、55.11、59.07,P值均＜0.01);当B(a)P染毒剂量达2.0 μmol/L后,16HBE-shPARP1细胞各剂量组(浓度由低到高)DNMT1基因mRNA相对表达水平分别为对照组的135.0%、151.0%、180.0%、229.0%、186.0%,差异有统计学意义(t值分别为23.82、40.17、32.69、74.85、46.76,P值均＜0.01).结论 B(a)P诱导的16HBE细胞基因组整体甲基化水平降低可能是其恶性转化过程中早期重要的分子事件,PARP1可通过抑制DNMT1的酶活性来调节B(a)P诱导的16HBE细胞DNA甲基化水平,这种效应可因PARP1的缺失而缓解.
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化学物暴露与白血病发病相关基因DNA甲基化对儿童急性白血病发病的影响
目的：探讨化学物暴露、白血病发病相关DNA甲基化改变以及二者交互作用与儿童急性白血病发病的关系。方法2009年1月1日至2010年12月31日，采用1∶1匹配的病例-对照研究方法，选取131例就诊于3家上海市三甲级儿童医院的0～15岁新发急性白血病患儿为病例组，选取病例所在医院的发育行为儿科或骨科门诊就诊或入院治疗与病例组同性别、同年龄的儿童为对照组，排除患血液系统疾病、肿瘤疾病等的儿童。对两组儿童进行相关环境因素的问卷调查，采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）分析病例组与对照组儿童8个与白血病发病相关的基因(P16、P73、E-cadherin、DAPK、C-ABL、HSPA4L、PTEN、APAF-1)的甲基化状态，并分析环境暴露因素与基因甲基化水平改变之间的交互作用，以相对超额危险度（RERI）、归因比（API）与交互作用指数（S）描述其交互作用。结果病例组和对照组分别为131和140例，年龄分别为（6.9±3.8）和（6.9±3.9）岁（t=0.01，P=0.911）。将混杂因素校正后，儿童期（OR=3.90，95%CI：1.69～9.02）、母亲孕前及孕期（OR=2.71，95%CI：1.12～6.52）、父亲在母亲怀孕前（OR=1.91，95%CI：1.05～3.47）接触化学物与儿童急性白血病发生相关。病例组儿童DAPK、PTEN、P73基因甲基化程度高于对照组儿童[病例组分别为：3.1%（4例），16.0%（21例），7.6%（10例）；对照组分别为：0.7%（1例），2.9%（4例），0.7%（1例），χ2值分别为7.11、16.90、11.38，P值分别为0.029、0.000、0.003]，但病例组P16基因的甲基化程度低于对照组儿童[病例组比对照组：3.8%（5例）比8.6%（12例），χ2=10.33, P=0.007]。环境-基因交互作用结果显示，儿童化学物质接触史与PTEN、P16、P73等3种基因存在交互作用（PTEN：RERI=-7.01，API=-2.14，S=0.24；P16：RERI=4.08，API=0.53，S=2.59；P73：RERI=4.32，API=0.48，S=2.19）；母亲孕前或孕期化学物质接触史与PTEN、P16基因亦存在交互作用（PTEN：RERI=-1.30，API=-0.38，S=0.65；P16：RERI=1.70，API=0.38，S=1.97）。结论儿童不同发育阶段接触化学物质、多种基因DNA甲基化水平改变均是儿童急性白血病发病的危险因素，且两者呈现出不同程度的交互作用，可能在儿童急性白血病的发病过程中发挥着重要作用。
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p53基因甲基化和突变与燃煤污染型砷中毒关系研究
目的 探讨燃煤砷污染对人体p53基因甲基化(启动子区及第5外显子)和突变(第5外显子)的影响,分析其与燃煤型砷中毒的关系.方法 在贵州省兴仁县燃煤型砷中毒病区选择112例砷中毒患者,根据病情将其分为轻度中毒组(38例)、中度中毒组(43例)和重度中毒组(31例);根据有皮肤病理学诊断患者(43例)的病理结果,将其分为非癌变组(24例)和癌变组(19例).选择条件相似的非砷暴露村90名居民作为对照组.在知情同意原则下,采集上述观察对象的外周血,应用限制性内切酶-PCR法检测p53基因启动子区及第5外显子甲基化情况,应用PCR-单链构象多态性技术及PCR产物克隆测序技术检测p53基因第5外显子突变情况.结果 p53基因启动子区甲基化阳性率在轻、中、重度组分别为13.16%(5/38)、27.91%(12/43)、45.16%(14/31),与对照组[1.11%(1/90)]比较差异均有统计学意义(χ2值分别为8.679、23.690、41.199,P值均＜0.017);在非癌变组和癌变组分别为25.00%(6/24)和63.16%(12/19),与对照组[1.11%(1/90)]比较差异均有统计学意义(χ2值分别为18.762、57.497,P值均＜0.025).p53基因第5外显子甲基化阳性率在轻、中、重度组分别为55.26%(21/38)、51.16%(22/43)、48.39%(15/31),与对照组[88.88%(80/90)]比较差异有统计学意义(χ2值分别为18.151、23.168、22.420,P值均＜0.017);在非癌变组和癌变组分别为54.17%(13/24)和42.11%(8/19),与对照组[88.88%(80/90)]比较差异有统计学意义(χ2值分别为15.201、22.075,P值均＜0.025).p53基因第5外显子突变率在轻、中、重度组分别为5.26%(2/38)、16.28%(7/43)、25.81%(8/31),中、重度组与对照组(0.00%)比较差异均有统计学意义(χ2值分别为15.465、24.870,P值均＜0.017);在非癌变组和癌变组分别为16.67%(4/24)、31.58%(6/19),与对照组(0.00%)比较差异均有统计学意义(χ2值分别为15.545、30.077,P值均＜0.025).启动子区高甲基化与第5外显子突变相关(列联系数为0.294,P＜0.05);第5外显子低甲基化与第5外显子突变相关(列联系数为0.410,P＜0.05).结论 燃煤砷污染可致人体p53基因启动子区高甲基化、第5外显子低甲基化和突变,上述甲基化改变均与p53基因突变相关联;p53基因甲基化改变可能是砷致p53基因突变以及砷致病或致癌的重要原因之一.
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砷化物所致细胞恶性转化的信号通路研究进展
众多研究证实,长期摄入砷化物可引起多种癌症,因此,砷化合物已被国际癌症协会确认为人类确定致癌物[1],但由于砷化物致癌的实验动物模型一直未能成功建立,从而导致其致癌机制研究长期滞后.虽已提出一些砷化物致癌作用的分子机制假说,如氧化应激、细胞增殖与凋亡异常、DNA甲基化异常、DNA损伤及信号通路改变等[2],但目前还没有一个被广泛认可且具有说服力的砷化物致癌机制.近年来,国内外应用低水平砷化物所致细胞恶性转化来探讨砷化物致癌的分子机制,取得较大研究进展.笔者主要就磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinases/protein kinase B,PI-3K/PKB)、丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)、鼠双微基因2(murine double minute-2, mdm2)、核因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)和致死蛋白-2(Mortalin-2,mot-2)抑制p53及其分子过程在砷化物所致细胞恶性转化过程中作用的研究进展作一综述.
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毛细管胶束电动色谱测定基因组DNA甲基化水平
DNA甲基化作为表遗传学的重要研究内容,是哺乳动物表达调控的主要表遗传学形式.研究表明,DNA甲基化与肿瘤关系密切[1-2],全基因组DNA低甲基化是肿瘤细胞基本特征之一[3-4],在肿瘤的发生和发展中存在DNA甲基化水平和模式的混乱.DNA甲基化改变能否作为生物标志用于临床早期诊断已成为当前研究的热点.目前,用于DNA整体甲基化水平检测方法有多种,但能真正从定量的角度进行快速、精确分析的方法却很少.笔者采用毛细管胶束电动色谱(miceller electrokinetic capillary chromatography,MECC)法同时分离DNA酶解后5类单核苷酸(包括mdC),建立了一种快速检测基因组DNA整体甲基化水平的方法.
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聚-ADP-核糖基化在六价铬诱导人支气管上皮细胞基因组DNA甲基化水平改变中的作用
目的 研究聚-ADP-核糖基化与DNA甲基化在六价铬[Cr(Ⅵ)]致癌过程中的作用,并对两者之间的联系进行探讨.方法 选用前期建立的聚-ADP-核糖水解酶(PARG)缺陷的人支气管上皮细胞(16HBE细胞)作为研究对象,使用Cr(Ⅵ)分别对正常16HBE细胞和PARG缺陷细胞进行处理,通过甲基化免疫荧光技术分析两种不同细胞基因组DNA整体甲基化水平变化,同时检测整体甲基转移酶活性的变化,并进一步利用RT-PCR和western-blotting分别从mRNA和蛋白水平上分析DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2)的表达变化.结果 正常16HBE细胞Cr(Ⅵ)处理24h后,基因组DNA甲基化水平降低,且具有剂量-效应关系,而PARG缺陷细胞此种表现不明显；当Cr(Ⅵ)的作用剂量为5.0 μmol/L时,16HBE细胞和PARG缺陷细胞内总体DNA甲基转移酶活性分别为49.33±2.65、80.05±2.05,较对照组(分别为99.27±1.10、99.30±0.60)下降了50％和20％.正常16HBE细胞Cr(Ⅵ)处理24 h后,DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MBD2的mRNA和蛋白水平表达均呈下降趋势.PARG缺陷细胞中DNMT1和DNMT3a的表达出现下调,0、0.3、1.2、5.0 μmol/LCr(Ⅵ)处理组胞内DNMT1 mRNA的相对表达量分别为0.99 ±0.04、0.79±0.05、0.65±0.08、0.51±0.10(F =544.13,P＜0.01),蛋白相对表达量分别为1.00±0.03、0.69±0.15、0.65 ±0.10、0.55±0.13(F=214.12,P＜0.01)；DNMT3a mRNA的相对表达量分别为1.00±0.04、0.93±0.11、0.79±0.07、0.59±0.05(F =498.16,P＜0.01),蛋白相对表达量分别为1.00 ±0.14、0.97 ±0.11、0.79±0.17、0.57 ±0.15(F =390.11,P＜0.01)；但DNMT3b和MBD2表达改变不明显.结论 聚-ADP-核糖基化可通过调节DNMT3b和MBD2的活性,对抗Cr(Ⅵ)诱导的广泛基因组低甲基化,维持细胞基因组整体甲基化水平的稳定.
关键词： 铬 DNA甲基化 人支气管上皮细胞 聚-ADP-核糖基化 -
镉暴露对人胚肾细胞TET酶表达及DNA甲基化水平的影响
目的：观察人胚肾细胞(HEK293)短期暴露于高剂量氯化镉（CdCl2）时，TET酶表达及DNA甲基化水平的变化。方法 HEK293细胞经CdCl2染毒24、48和72 h后，用细胞增殖与活性检测试剂盒（CCK-8）检测细胞存活率并记录细胞形态，Real-time PCR法检测mRNA表达水平，Western blot法检测TET3酶蛋白表达水平，并采用焦磷酸测序法检测全基因组DNA甲基化水平。结果细胞增殖及细胞存活率监测结果显示，CdCl2对HKE293细胞有毒性作用，其半数抑制浓度（IC50）为1.78μmol/L；CdCl2处理HEK293细胞24、48和72 h后，细胞形态发生改变，2.0μmol/L染毒组细胞呈空泡样变化且形态模糊。染毒剂量分别为0.0、0.5、1.0和2.0μmol/L时，TET1 mRNA相对表达量分别为0.23±0.13、0.48±0.12、0.59±0.16和0.95±0.39（F=182.89，P=0.002）；TET2 mRNA相对表达量分别为0.23±0.12、0.32±0.02、0.31±0.10和0.34±0.07（F=18.91，P<0.001）；TET3 mRNA相对表达量分别为0.26±0.10、0.27±0.11、0.25±0.11和0.28±0.09（F=1.76，P=0.036）。TET1 mRNA、TET2 mRNA和TET3 mRNA相对表达量在染毒时间和染毒剂量均有交互作用（F值分别为32.94、23.04和13.78，P值分别为<0.001、0.041和<0.001）。Western blot检测结果显示，TET酶蛋白表达量在不同时间梯度和浓度梯度的改变趋势与mRNA相对表达量一致。染毒时间分别为24、48和72 h时，全基因组DNA甲基化水平分别为(55.01±3.62)%、(48.31±8.99)%、(48.76±6.60)%（F=18.50，P<0.001）；染毒剂量分别为0.0、0.5、1.0和2.0μmol/L时，全基因组DNA甲基化水平分别为(55.29±2.83)%、(55.35±3.11)%、(48.58±6.40)%和(43.56±7.89)%（F=7.03，P=0.048）。全基因组DNA甲基化水平在剂量组和时间点有交互作用（F=2.73， P=0.043）。结论在CdCl2短期暴露下，随着染毒剂量和染毒时间的增加，TET酶mRNA和蛋白表达水平呈逐渐升高的趋势，且全基因组DNA也表现出去甲基化改变；镉作用于人胚肾细胞HEK293时，甲基化酶在其全基因组甲基化水平改变方面可能发挥了一定的调控作用。
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孕期邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯暴露对大鼠卵巢全基因组CpG岛甲基化水平的影响
目的 探讨邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)孕期暴露对雌性子代大鼠成年期卵巢组织的CpG岛甲基化水平的影响.方法 将20只7～8周龄Wistar孕鼠按随机数字表法随机分为染毒组和对照组,每组10只.于妊娠12 ～ 17 d,每天对两组孕鼠分别以1000 mg/kg的DEHP和1 ml/kg的玉米油进行灌胃.采用大鼠启动子甲基化加启动子甲基化芯片,分析出生70 d子鼠的卵巢组织中的甲基化差异基因,对基因进行功能和基因本体论( Gene Ontology,GO)分析,在甲基化水平差异明显的基因中随机选择胰岛素样生长因子结合蛋白1基因( Igfbp1)和整合素α基因(Itga3),进行亚硫酸氢钠测序法验证.结果 染毒组与对照组的卵巢组织全基因组甲基化水平具有差异的基因共计406个(P＜0.05),其中71个基因发生高甲基化,335个基因发生低甲基化. GO分析发现,发生甲基化改变的基因包括分子传感器活性、细胞成分、细胞、细胞过程、多细胞生物过程、刺激反应、生物学调节、生物过程调节、生殖、生殖过程、节律过程在内共11个GO分类的基因.Igfbp1、Itga3基因甲基化的亚硫酸氢钠测序验证结果与芯片分析结果一致.结论 孕期DEHP暴露改变了卵巢组织中基因的甲基化水平,可能是DEHP生殖发育毒性的机制之一.
关键词： 二乙基己基邻苯二甲酸 DNA甲基化 毒理遗传学 孕期暴露 -
SET基因缺陷对三氯乙烯诱导人正常肝细胞DNA甲基化水平改变的影响
目的 比较三氯乙烯(trichloroethylene)诱导人正常肝细胞(L-02细胞)和SET基因缺陷L-02细胞(SET缺陷细胞)中DNA甲基化相关指标的变化,探讨SET与三氯乙烯诱导的表观遗传调控作用之间的关系.方法 选用前期建立的SET缺陷细胞为研究对象,使用三氯乙烯分别对L-02细胞和SET缺陷细胞进行处理,检测细胞增殖水平、细胞DNA甲基化水平和DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases,DNMTs)活性的变化,通过Western blot法从蛋白水平分析DNMTs(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)的表达变化.结果 三氯乙烯处理L-02细胞和SET缺陷细胞24 h后,两种细胞的增殖水平均呈现下降趋势.使用0、1.0、2.0、4.0和8.0 mmol/L的三氯乙烯处理细胞后,L-02细胞的相对增殖水平分别为100.00 ±2.70、83.34±2.38、75.56±4.51、71.67±2.77、66.67±1.63(F=58.29,P＜0.001);SET缺陷细胞的相对增殖水平分别为101.12±1.67、85.01±2.33、79.44±1.67、78.337±3.89、76.11 ±3.33(F=42.41,P＜0.001).0、1.0、2.0、4.0和8.0 mmol/L的三氯乙烯处理L-02细胞和SET缺陷细胞24 h后,L-02细胞的DNA甲基化水平分别为3.77 ±0.08、3.48 ±0.08、3.38 ±0.10、3.14 ±0.15、2.91 ±0.07,呈下降趋势(F =212.87,P＜0.001);SET缺陷细胞DNA甲基化水平分别为3.77 ±0.15、3.57 ±0.15、3.30±0.11、3.35±0.13呈下降趋势(F =79.32,P＜0.001).L-02细胞经0、1.0、2、0、4.0、8.0 mmol/L的三氯乙烯处理24 h后,DNMT1蛋白的相对表达量分别为1.00±0.03、1.28±0.04、1.20±0.04、1.62±0.05、1.43 ±0.04,表达升高(F=103.00,P＜0.001);而在SET缺陷细胞中DNMT1的相对表达量分别为1.00±0.04、0.96±0.02、1.19 ±0.05、0.85±0.03、0.83±0.03,出现下降(F =44.18,P＜0.001).结论 SET缺陷可以明显抑制三氯乙烯暴露引起的L-02细胞增殖水平及DNMTs活性的下降,改变DNMT1表达水平的变化趋势,提示SET参与了在三氯乙烯诱导下的肝毒性作用和表观遗传学调控机制.
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活血解毒中药对动脉粥样硬化小鼠血清PGI2/TXA2及DNA甲基化水平的干预作用
目的 探讨活血(血府逐瘀胶囊)、解毒(四季三黄胶囊)以及活血解毒中药联合应用对高脂喂养的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)模型前列环素/血栓素A2(PGI2/TXA2)及DNA甲基化水平的影响.方法 50只6～8周龄ApoE-/-小鼠予高脂喂养7周后,随机分为模型组、立普妥(阿托伐他汀钙)组、血府逐瘀胶囊组、四季三黄胶囊组与活血+解毒组,继续灌胃和高脂喂养6周后,测其血脂、PGI2/TXA2及血清DNA甲基化和DNMTs水平.结果 与模型组比较,血府逐瘀胶囊组、四季三黄胶囊组与联合应用组总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇水平均有不同程度的降低,AS斑块相对面积、血清DNA甲基化水平与DNMTs水平均显著降低(P＜0.01),PGI2/TXA2比值显著升高(P＜0.01).结论 活血解毒中药复方血府逐瘀胶囊、四季三黄胶囊及其联合应用可显著改善ApoE-/-小鼠AS模型PGI2/TXA2比值、DNA甲基化与DNMTs水平,从而可能对AS起到一定防治作用.
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活血解毒中药对动脉粥样硬化小鼠斑块稳定性、血脂及DNA甲基化水平的影响
目的 研究血府逐瘀胶囊、四季三黄胶囊及其联合应用对动脉粥样硬化(As)小鼠主动脉斑块稳定性、血脂及血清DNA甲基化水平的影响.方法 对ApoE基因敲除小鼠予高脂饮食喂养13周后随机分组,后再继续喂养13周,同时给予药物治疗.处死采血,检测血脂、血清DNA甲基化及甲基化转移酶(DNMTs)水平,并取出心脏及主动脉,石蜡包埋,取主动脉根部的第3切面,行HE染色,经IPP图像分析,测量并计算主动脉As斑块纤维帽的平均厚度及斑块内细胞外脂质占斑块面积的百分比.结果 与模型组相比,辛伐他汀组、血府逐瘀胶囊组、四季三黄胶囊组和联合应用组小鼠主动脉斑块的平均纤维帽厚度明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05);与血府逐瘀胶囊组和四季三黄胶囊组相比,联合应用组的平均纤维帽厚度明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).与模型组比较,辛伐他汀组、血府逐瘀胶囊组、四季三黄胶囊组和联合应用组小鼠主动脉斑块内细胞外脂质成分占斑块面积的百分比明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).与模型组比较,辛伐他汀组、血府逐瘀胶囊组、四季三黄胶囊组和联合应用组小鼠甘油三酯(TG)水平明显降低(P＜0.05).仅辛伐他汀组血清LDL-C和TC水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05),其余给药组差异均无统计学意义(P＞0.05).经ELISA法检测,给药13周后,辛伐他汀组、血府逐瘀胶囊组、四季三黄胶囊组和联合应用组小鼠血清DNA甲基化水平和DNMTs水平明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05),但组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 血府逐瘀胶囊、四季三黄胶囊及其联合应用均具有降低血清TG水平,稳定As斑块的作用,其机制可能与提高血清中DNA甲基化水平和DNMTs水平有关.
