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p21 ras和nm23-H1表达与胃癌淋巴结转移的关系
为探讨p21 ras和nm23-H1表达与胃癌淋巴结转移的关系,采用LSAB法观察了80例胃癌患者的p21 ras和nm23-H1的表达,并分析其与淋巴结转移的关系.结果:有淋巴结转移(LNM)组p21 ras表达阳性率(62.5%)明显高于无LNM组(42.5%),但nm23-H1表达阳性率(27.5%)则明显低于无LNM组(47.5%);LNM数为1～3枚的p21 ras表达阳性率(33.3%)明显低于4～7枚和＞8枚的LNM组(45.8%和71.4%);N1组的表达阳性率(36.4%)明显低于N2和N3组(52.2%和83.3%).LNM为1～3枚的nm23-H1表达阳性率(44.4%)明显高于4～7枚和＞8枚的LNM组(25.0%和0%),LNM为4～7枚组的nm23-H1表达阳性率明显高于＞8枚组;N1组nm23-H1表达阳性率(45.5%)明显高于N2和N3组(21.7%和0%).上述结果提示,胃癌p21 ras和nm23-H1的表达与淋巴结转移密切相关,可作为胃癌患者预测转移和预后的指标.
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nm23-H1抑制原发性肝癌细胞转移的初步机理研究
为了更深入阐明nm23-H1抑制原发性肝癌转移的作用机理,观察nm23-H1表达状况对肝癌细胞浸润相关因素的影响,本实验采用基因转染手段,将外源nm23-H1全长cDNA导入肝癌细胞并以此观察细胞体外浸润能力、细胞内游离Ca2+以及N-ras基因mRNA表达的变化.结果: nm23-H1转染组发生侵袭的癌细胞数下降(P＜0.05); N-ras mRNA丰度明显降低(P＜0.05); 细胞内游离Ca2+浓度增高(P＜0.05).结果提示: nm23-H1影响原发性肝癌细胞浸润与转移可能是通过调节癌细胞内的信息传导而实现的.
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逆转录聚合酶链反应技术检测人肝癌nm23-H1基因mRNA表达
为探讨人肝癌中肿瘤转移抑制基因nm23-H1的mRNA表达状况,设计特异性引物,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测分析了20例人肝癌组织及相应癌旁肝组织中nm23-H1基因的mRNA表达.结果: 特异性引物能成功扩增nm23-H1基因的几乎整个编码序列; 20例肝癌及癌旁肝组织的RT-PCR结果均为阳性,nm23-H1基因mRNA未发生表达缺失或较大变异现象.由此表明: 本实验建立的RT-PCR方法为进一步定量测定肝癌组织中nm23-H1 mRNA表达水平奠定了基础.
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nm23-H1 基因杂合性缺失及突变与大肠癌转移抑制
应用Southern印迹杂交和RT-PCR-SSCP银染、克隆及序列测定检测了36例大肠癌组织标本中nm23-H1杂合性缺失和突变情况.结果: 本组标本nm23-H1杂合性缺失率为29.63%,Duke's D期及远处转移大肠癌有较高的杂合性缺失发生率; 大肠癌中未见nm23-H1基因突变.本实验结果提示: nm23-H1基因杂合性缺失可能参与大肠癌恶性进展及转移过程的调节,该基因突变在大肠癌中所起的作用可能较小.
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nm23-H1与CD44v6在非小细胞肺癌中的表达及临床意义
目的探讨nm23-H1与CD44v6在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及其临床意义.方法采用免疫组化SP法检测147例NSCLC 标本中nm23-H1、CD44v6的表达.结果全组nm23-H1阳性率为62.6%(92/147),其中Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期,N0组与N1～3组间阳性率无显著性差异(P＞0.05),高、中分化组与低分化组,腺癌与鳞癌,生存期低于3年组与生存期超过3年组间阳性率有显著性差异(P＜0.05).CD44v6阳性率为63.9%(94/147),其中Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期,N0组与N1～3组间阳性率无显著性差异(P＞0.05),高、中分化组与低分化组,鳞癌与腺癌,生存期低于3年组与生存期超过3年组间阳性率有显著性差异(P＜0.05).nm23-H1(+)CD44v6(-)者的预后明显好于nm23-H1(-)CD44v6(+)(P＜0.01).结论 nm23-H1和CD44v6的表达与NSCLC的分化程度、病理类型及预后密切相关,与PTNM分期及淋巴结是否转移无关.nm23-H1(+)CD44v6(-)者比nm23-H1(-)CD44v6(+)的预后佳.
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野生型和突变型nm23-H1基因原核表达载体的构建、表达及纯化
背景与目的 nm23-H1基因是一个肿瘤转移抑制基因,但关于nm23-H1基因抑制肿瘤转移的生化机理目前并不清楚.该实验目的就是构建nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,并在大肠杆菌中表达及纯化.方法 通过PCR方法扩增野生型和突变型nm23-H1目的片断,利用基因重组技术构建pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体,并进行酶切和测序鉴定,鉴定正确克隆转化BL21(DE3)溶源菌,进行蛋白表达及可溶性分析,同时采用镍柱亲和层析法进行纯化,应用Western blot方法对纯化后蛋白进行鉴定检测.结果 通过酶切和测序鉴定,pET28a-nm23-H1野生型和突变型原核表达载体序列正确,编码框正确.转化溶源菌后能够表达目的蛋白,蛋白表达量高,且均为可溶性蛋白,Western blot检测结果提示野生型和突变型nm23-H1蛋白分子量为20 kDa,与预计值相符.结论 成功构建pET28a-nm23-H1野生型和P96S、H118F突变型原核表达载体,所表达蛋白可用于下一步实验研究.
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nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建
背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.
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nm23-H1基因点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981的GSK-3β激酶活性的影响
背景与目的我们的前期研究结果表明nm23-H1基因的肺癌转移抑制作用可能与上调Wnt信号通路中关键激酶GSK-3β的活性、进而抑制Wnt信号通路相关.本研究的目的是探讨nm23-H1点突变对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中胞质和胞核的GSK-3β激酶活性的影响,为阐明nm23-H1基因调控肺癌转移相关信号传导通路的分子机制提供实验依据.方法将原代人低转移大细胞肺癌细胞株NL9980、原代人高转移大细胞肺癌细胞株L9981、空载体转染细胞株L9981-pEGFP、稳定转染nm23-H1基因的细胞株L9981-nm23-H1-pEGFP以及稳定转染在44、96、118、120号位点发生突变后的nm23-H1基因的转基因肺癌细胞株L9981-nm23-H1 S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1H118F-pEGFP和L9981-nm23-H1S120G-pEGFP作为研究对象,应用免疫共沉淀同位素闪烁计数法测定上述肺癌细胞株胞质和胞核中的GSK-3β激酶活性.结果nm23-H1基因发生点突变后,所有转基因肺癌细胞株细胞胞质和胞核中的GSK-3β活性均较突变前有所下降.L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP、L9981-nm23-H1 H118F-pEGFP、L9981-nm23-H1 S120G-pEGFP分别与L9981-nm23-H1-pEGFP比较,胞质与胞核中GSK-3β激酶活性均存在显著性差异(P＜0.05),其中L9981-nm23-H1P96S-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP胞质中GSK-3β活性存在极显著差异(P＜0.01),L9981-nm23-H1S44A-pEGFP、L9981-nm23-H1P96S-pEGFP和L9981-nm23-H1 H118F-pEGFP与L9981-nm23-H1-pEGFP的胞核中GSK-3β活性存在极显著差异(P＜0.01).结论①nm23-H1基因突变能显著影响其对人高转移大细胞肺癌细胞株L9981胞质和胞核中GSK-3β激酶活性的调控作用;②nm23-H1基因可能通过调控L9981中GSK-3β激酶活性来抑制L9981细胞株中Wnt信号传导.
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人肺癌细胞株L9981-nm23-H1的建立
目的建立转染野生型nm23-H1基因的人大细胞肺癌细胞株L9981 nm23-H1.方法应用基因克隆技术构建逆转录病毒载体pLXSN-nm23-H1EGFP.脂质体法转染PA317细胞,得到逆转录病毒,并将病毒感染L9981细胞,获得L9981-nm23-H1.应用PCR和Western blot检测L9981-nm23-H1细胞中nm23-H1基因及其蛋白表达.结果成功构建了逆转录病毒载体pLXSN-nm23-H1-EGFP.nm23-H1cDNA导入到L9981细胞株中,并检测到L9981-nm23-H1细胞中有nm23-H1蛋白表达.结论nm23-H1基因在细胞株L9981-nm23-H1中能持续、稳定和高效表达.
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高温对人舌鳞癌细胞中nm23-H1基因表达影响的实验研究
目的 研究高温治疗癌症与转移抑制基因nm23-H1之间的关系,探讨高温抑制肿瘤细胞侵袭及转移的机理.方法 对人舌鳞癌Tca8113细胞行体外43℃加温,采用电镜、免疫组织化学及流式细胞术等方法,分析加热后舌癌细胞超微结构的变化及nm23-H1表达量的改变.结果 加温使Tca8113细胞中细胞器增多,形态趋向良性分化.在加热43℃时随加热时间延长,细胞中nm23-H1表达量增加,在加热30 min时达到高,此变化不随加热后培养时间的增加而改变.结论 高温能使肿瘤细胞中nm23-H1表达量增加,并使细胞形态出现一定分化,从而抑制肿瘤细胞的侵袭、转移能力.43℃加热30 min可能是临床治疗舌鳞癌的理想位点.
关键词： 人舌鳞癌 TCA8113细胞株 高温 nm23-H1基因 -
nm23-H1基因在口腔鳞癌颈淋巴结转移不同阶段的调控作用
目的探讨nm23-H1基因在口腔鳞癌区域淋巴结转移不同阶段的调控作用及影响.方法利用免疫组化和Western Blot技术,结合淋巴结转移和原发灶浸润分型的资料,分组对照研究nm23-H1基因在200例口腔鳞癌颈淋巴结转移不同阶段的表达情况.结果淋巴结转移组nm23-H1基因阴性表达率明显高于无淋巴结转移组(P<0.01).N1期、转移仅累及1个淋巴结、Ⅳc型浸润,以及低分化肿瘤的患者,均有比其它患者明显增高的nm23-H1基因的阴性表达率(P<0.01);转移至颌下或颌下-颈深上淋巴结平面者的阴性表达率,也高于转移到其它平面者(P<0.05).结论 nm23-H1基因主要是通过干扰肿瘤实体内高转移细胞亚群的形成和初始转移的发生来调控口腔鳞癌患者的颈淋巴结转移.
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应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒
利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定.结果 经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段.结论 利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒.
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肿瘤转移抑制基因nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞株的转染及表达
目的:探讨nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞株的转染及表达.方法:采用已经通过基因工程技术构建的nm23-H1基因的真核表达载体,利用电穿孔基因转染技术将nm23-H1基因导入人膀胱癌T-24细胞,利用G418筛选、免疫组织化学、流式细胞方法检测nm23-H1基因的转录和表达情况.结果:以电穿孔转染技术将nm23-H1基因转染T-24细胞后,经400ml/L的G418筛选后可形成抗性克隆;免疫组织化学和流式细胞结果显示转基因细胞中有nm23-H1蛋白的阳性高表达.结论:nm23-H1基因可被成功转染入人膀胱癌T-24细胞并能有效表达.
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nm23-H1基因对 T-24细胞株侵袭、粘附和趋化性影响的实验研究
目的 探讨nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞株的转染及表达,观察nm23-H1对人膀胱癌T-24细胞侵袭转移能力的影响.方法 ①采用已经通过基因工程技术构建的nm23-H1基因的真核表达载体,利用电穿孔基因转染技术将nm23-H1基因导入人膀胱癌T-24细胞,利用G418筛选、免疫组织化学、流式细胞方法 检测nm23-H1基因的转录和表达情况.②利用Transwell小室和冲刷实验,观察转染前后细胞的侵袭、粘附、趋化运动能力的变化.结果 以电穿孔转染技术将nm23-H1基因转染T-24细胞后,获得稳定表达;免疫组织化学和流式细胞结果 显示T-24细胞株nm23-H1基因的传染前后表达水平有明显差异;发现转染后T-24细胞侵袭、粘附、趋化运动能力有明显的降低.结论 nm23-H1基因对人膀胱癌T-24细胞的侵袭转移能力具有显著抑制作用.
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口腔鳞癌nm23-H1基因存在状态和颈淋巴结转移的关系
目的：探讨口腔鳞癌中nm23-H1基因结构变化和表达水平及其和颈淋巴结转移的关系。方法：用PCR 法扩增了30 例人口腔鳞癌，7 例正常口腔粘膜标本及人舌鳞癌细胞系TSCCa和人口腔转移癌细胞系GNM nm23-H1基因，并对PCR 产物进行SSCP分析；用原位杂交法检测鳞癌组织及两细胞株nm23-H1 mRNA水平，对其和颈淋巴结转移的关系进行统计学分析。结果：除1 例口腔鳞癌外，所有标本均无nm23-H1结构变化；9 例有转移的口腔鳞癌组织中有7 例nm23-H1 mRNA表达阴性，而21 例无转移患者只有5 例表达阴性，且GNM nm23-H1阳性率低于TSCCa(41.2%对63.1%),nm23-H1表达与癌转移呈显著负相关（P<0.01)；nm23-H1表达和组织学分级无关。结论：nm23-H1 mRNA水平的变化不是由基因结构变化导致；nm23-H1基因产物对口腔鳞癌颈淋巴结转移有抑制作用。
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nm23-H1基因表达与乳腺癌转移的相关性
目的探讨nm23-H1基因在乳腺癌中的表达及临床意义. 方法采用免疫组化(S-P法)对68例乳腺癌nm23-H1基因蛋白进行检测,并结合临床资料进行分析. 结果乳腺癌腋淋巴结阳性与阴性组、远处转移与无远处转移组nm23-H1基因高表达分别为56.8%比83.8% (P<0.05)和41.2%比78.4% (P<0.01),两组间均有显著差异. nm23-H1基因表达与年龄、病理类型、临床分期、ER、PR表达无显著相关. 结论 nm23-H1基因表达与乳腺癌腋淋巴结转移和远处转移呈负相关.
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nm23-H1基因在结肠癌中的表达及其意义
目的:研究肿瘤转移相关基因nm23-H1在结肠癌中的表达及其与临床病理的关系.方法:应用SP免疫组化法对4例正常结肠组织、4例结肠腺瘤组织、28例结肠癌组织中的nm23-H1基因进行半定量分析.结果:nm23-H1表达强度在正常结肠组织、结肠腺瘤组织、结肠癌组织中的水平差异不大.结肠癌中nm23-H1在伴淋巴结转移组的表达强度明显低于不伴淋巴结转移组(P＜0.05),Dukes C、D期低于Dukes A、B期(P＜0.05).结论:nm23-H1基因可能参与结肠癌的发生、发展,其表达强度与结肠癌的淋巴结转移呈负相关.
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癌组织nm23-H1基因表达对胃肠道癌浸润与转移的影响及意义
目的通过检测、分析癌组织中nm23-H1基因表达,探讨nm23-Ht对胃肠道癌浸润、转移的影响及临床意义.方法应用免疫组化技术检测62例胃肠道癌术后标本nm23-H1基因的蛋白表达,采用x2检验进行统计学分析.结果nm23-H1在胃肠道癌组织中的阳性表达率为62.9%(39/62),Ⅰ+Ⅱ与Ⅲ+Ⅳ患者之间nm23-H1的阳性表达有显著性差异(P＜0.05).nm23-H1的表达与局部淋巴结转移呈负相关(P＜0.01).在高分化组nm23-H1的表达明显降低(P＜0.05),与癌栓的形成无关(P＞0.05).结论癌组织中nm23-H1基因的蛋白表达增强或减弱可能与胃肠道肿瘤转移有内在联系;可通过调控癌细胞的转移潜能,影响胃肠道癌浸润和淋巴结转移;可作为胃肠道肿瘤判断预后的指标,指导临床正确综合治疗.
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nm23-H1基因CpG岛甲基化与食管癌的关系
肿瘤细胞普遍存在DNA甲基化模式的改变,DNA甲基化异常包括原癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化.近年来研究结果表明,在食管癌发生过程中同样存在相关抑癌基因启动子区甲基化导致的基因表达的紊乱,其中由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)和去甲基化酶的活性改变导致的抑癌基因CpG岛超甲基化的研究,已成为食管癌发病机制研究中的热点之一.
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Nm23-H1基因对膀胱癌化疗敏感性的体外实验研究
目的: 探讨外源性人抑癌基因nm23-H1对膀胱癌细胞系T-24细胞化疗敏感性的影响.方法: 将nm23-H1真核表达质粒通过脂质体转染技术导入人膀胱癌细胞株T-24,利用免疫组化及Western-blot法鉴定质粒的表达.利用MTT法、流式细胞仪分析技术检测T-24细胞转染前后化疗药物对细胞增殖、细胞凋亡的变化.结果: 顺铂组(CDDP)细胞生长明显受到抑制,细胞凋亡增加;顺铂转染前后细胞凋亡指数分别为(26.51±0.98)%、(63.21±0.58)%,两者间差异有统计学意义.结论: Nm23-H1基因能增强顺铂的化疗敏感性,为基因联合化疗药物治疗膀胱癌提供了参考依据.
