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反油酸对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞线粒体功能和细胞自噬的影响
目的 研究反油酸对人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞线粒体功能和细胞自噬的影响.方法 体外培养人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞,加入不同剂量(0、10、20、50和100 μmol/L)的反油酸,24 h后收集细胞,采用透射电镜观察细胞自噬小体;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞活力;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)和蛋白免疫印迹(western blot)方法检测细胞自噬相关的基因和蛋白表达水平.结果 透射电镜观察细胞结构发现,50和100 μmol/L反油酸可使细胞内出现自噬小体,并可以引起细胞活力下降,差异均有统计学意义(P＜0.01);100 μmol/L反油酸作用24和48 h后,细胞活力明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);100 μmol/L反油酸可使SH-SY5Y细胞中细胞色素C(cytochrome c,cyt-c)基因Mrna表达水平明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);随着反油酸浓度的升高,细胞浆中cyt-c蛋白表达水平逐渐升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).但是不同剂量的反油酸对SH-SY5Y细胞自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)基因、Beclin1基因、p62基因、自噬相关基因5(atg5)、自噬相关基因12(atg12)Mrna水平表达差异无统计学意义(P＞0.05);但与对照组比较,50和100 μmol/L反油酸可使SH-SY5Y细胞LC3B和Beclin1蛋白表达水平逐渐上调,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 反油酸可以引起人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞活力下降,可能与其引起细胞自噬小体形成,上调自噬相关蛋白表达水平,促进线粒体cyt-c蛋白释放入细胞浆有关.
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石斛合剂对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用
目的:探讨石斛合剂对过氧化氢(H2O2)诱导SH-SY5Y细胞凋亡保护作用及可能机制.方法:采用体外细胞培养的方法,建立SH-SY5Y细胞H2O2损伤模型.予以石斛合剂含药血清干预后测定细胞存活率(MTT法)、乳酸脱氢酶(LDH)活性,检测细胞凋亡线粒体膜电位(MMP),Western blot检测bax、bcl-2蛋白表达变化.结果:与模型组比较,石斛合剂能减轻H2O2引起的SH-SY5Y细胞损伤,能明显提高细胞的存活率(P＜0.05),减少LDH的释放量(P＜0.01),稳定线粒体膜电位(P＜0.01),使bax蛋白表达下降(P＜0.05),bc1-2蛋白表达升高(P＜0.05).结论:石斛合剂可抑制H2O2诱导的SH-SY5Y细胞凋亡,其机制可能是通过抗氧化来实现的.
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莫诺苷抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y神经细胞钙超载和细胞毒
目的 研究莫诺苷抑制过氧化氧诱导的SH-SY5Y神经细胞钙超载和细胞毒作用.方法 体外培养的人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞分别加入莫诺苷1μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L预孵育24 h,加入H2 O2 300～500 μmol/L,作用18 h,检测细胞内游离钙离子浓度、乳酸脱氢酶(LDH)释放率.结果 与未加莫诺苷预孵育的细胞相比,莫诺苷10μmol/L、100μmol/L能抑制神经细胞内游离钙离子浓度增加,莫诺苷1μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L能降低LDH的释放率.结论 莫诺苷能够抑制H2O2诱导的SH-SY5Y神经细胞钙超载和细胞毒,有神经保护作用.
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脑红蛋白在氧糖剥夺-复氧复糖诱导人神经母细胞瘤细胞线粒体膜电位去极化及活性氧生成中的作用
目的：探讨脑红蛋白（ NGB）在氧糖剥夺-复氧复糖诱导的人神经母细胞瘤细胞线粒体膜电位去极化及活性氧生成中的作用。方法在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中，使用慢病毒干扰NGB表达，建立NGB 表达敲减及相应的空载病毒稳转株。细胞行氧糖剥夺-复氧复糖处理。荧光实时定量PCR检测人神经母细胞瘤细胞NGB mRNA表达水平，免疫印迹检测人神经母细胞瘤细胞NGB蛋白表达水平。线粒体膜电位特异性染料JC-1染色，观察线粒体膜电位变化。 DCFH-DA染色，检测细胞内总活性氧水平。检测人神经母细胞瘤细胞释放乳酸脱氢酶（ LDH）活性。结果氧糖剥夺-复氧复糖后，NGB mRNA及蛋白水平升高，分别于4 h和8 h达高峰（2.04±0.35，1.69±0.18）。 NGB转染干扰NGB慢病毒较转染空载病毒线粒体膜电位去极化水平降低[荧光比值（ JC-1红色／绿色比值）1.10±0.10比1.46±0.11，P＜0.05]，总活性氧产生增多[（36.30±5.32）荧光强度／细胞比（16.26±2.97）荧光强度／细胞， P ＜0.05]，且 LDH 释放增多[（63.42±6.14）％比（49.65±5.09）％，P＜0.05]。结论 NGB对维持线粒体稳态起重要作用。干扰NGB表达可导致细胞在缺血缺氧状况下线粒体损伤加重，活性氧释放增多，细胞损伤加重。
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玛咖多糖对过氧化氢诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤的保护作用
目的 探讨玛咖多糖对过氧化氢诱导的人神经母细胞瘤细胞损伤的保护作用及其作用机制.方法 采用体外细胞培养的方法,建立人神经母细胞瘤细胞的过氧化氢损伤模型,并给予玛咖多糖预保护.观察细胞形态,MTT法测定细胞存活率,测定培养液中乳酸脱氢酶活性,以及胞浆中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力.流式细胞仪检测细胞活性氧酶含量以及细胞周期.结果 与过氧化氢模型组相比,玛咖多糖给药组可明显提高细胞的存活率,减轻过氧化氢引起的人神经母细胞瘤细胞的损伤,且呈浓度依赖性关系,可减少乳酸脱氢酶的释放,提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力,缓解细胞周期S-期阻滞.结论 玛咖多糖对过氧化氢诱导的人神经母细胞瘤细胞有明显的保护作用,其机制可能与提高抗氧化酶活力,减少细胞凋亡有关.
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PBDE-47对人神经母细胞瘤细胞凋亡和线粒体膜电位及细胞色素C蛋白表达的影响
目的 探讨PBDE-47对人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞线粒体膜电位和细胞色素C(Cyt C)蛋白表达的影响及其与细胞凋亡的关系.方法 将处于对数生长期的SH-SY5Y细胞分别加入终浓度为0(溶剂对照组)、1、5、10μmol/L的PBDE-47暴露24 h.采用流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化,采用Western blot技术检测胞浆与线粒体细胞色素C蛋白表达的水平.结果 与溶剂对照组相比,10 μmol/L PBDE-47染毒组SH-SY5Y细胞凋亡率和5、10 μmol/L PBDE-47染毒组胞浆内细胞色素C蛋白表达水平均明显升高,10 μmol/L PBDE-47染毒组线粒体膜电位和各浓度PBDE-47染毒组线粒体内细胞色素C蛋白表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).且随着PBDE-47染毒浓度的升高,SH-SY5Y细胞凋亡率和胞浆内细胞色素C蛋白表达水平呈升高趋势,线粒体内细胞色素C蛋白表达水平呈下降趋势.结论 PBDE-47可通过引起线粒体膜通透性转运孔开放和细胞色素C的释放介导SH-SY5Y细胞凋亡,从而对SH-SY5Y细胞产生损伤.
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7-硝基吲唑对氟致SH-SY5Y细胞凋亡及一氧化氮合成酶含量的影响
目的 探讨神经元型一氧化氮合成酶(nNOS)抑制剂7-硝基吲唑(7-nitroindazole,7-NI)对氟致体外培养细胞生长、凋亡保护作用的机制.方法 体外培养SH-SY5Y细胞,在培养液中加入不同浓度NaF(0、0.02、0.2、2.0、4.0 mmol/L),分别培养24、48、72h,同时在各组细胞培养液中联合应用7-NI(10-4、10-3、10-2 mmol/L);于倒置显微镜下观察细胞生长,以CCK-8试剂盒方法检测细胞存活率,以比色法和硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO含量及NOS活力,以流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 与对照组比较,氟浓度为0.2 mmol/L(低氟组)和2.0 mmol/L(高氟组)时,24、48、72 h后细胞存活率分别下降至(83.76±1.04)％,(70.27±1.20)％,(54.40±0.98)％和(52.17±1.07)％,(40.60±1.11)％,(29.50±1.40)％.10-4mmol/L 7-NI可刺激细胞增殖,24h细胞存活率为(105.96±3.44)％;l0-3mmol/L 7-NI处理细胞24 h后的细胞存活率为(100±2.30)％;10-2mmol/L 7-NI可使细胞存活率下降,24h细胞存活率为(88.64±4.75)％.10-4、10-3、10-2 mmol/L 7-NI处理细胞24 h后细胞培养液中NO含量、NOS活力均降低,分别为(1.156±0.356)、(0.958±0.074)、(0.672±0.188)μmol/L和(0.403±0.089)、(0.398±0.010)、(0.103±0.076)U/ml.高剂量(10-2 mmol/L)7-NI组的SH-SY5Y细胞凋亡指数升高至(8.7±2.3)％,高于对照组(P＜0.05);低剂量(10-4、10-3 mmol/L)7-NI组的凋亡指数分别为(0.6±0.4)％和(1.0±0.2)％,与对照组差异无统计学意义(P＜0.05);低剂量7-NI组凋亡指数低于高剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05).染氟24、48、72 h后细胞培养液中NO含量及NOS活力升高,低氟组的NO含量、NOS活力分别为(3.074±0.160)、(5.604±1.374)、(10.173±1.307)μmol/L和(0.743±0.122)、(0.959±0.054)、(1.446±0.12)U/ml,高氟组分别为(8.974±0.919)、(14.729±1.241)、(20.976±0.712)μmol/L和(1.086±0.024)、(1.728±0.130)、(2.583±0.192)U/ml,高于对照组[(1.320±0.280)、(2.420±0.658)、(2.867±0.662)μ.mol/L,(0.452±0.012)、(0.517±0.072)、(0.607±0.013)U/ml],差异有统计学意义(P＜0.05).与氟单独处理组相比,NaF联合应用7-NI后,各组NO含量及NOS活力均下降,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,氟可使SH-SY5Y细胞凋亡指数升高,差异有统计学意义(P＜0.01),并随着氟染毒剂量及时间的增加,细胞凋亡指数随之增加;联合应用7-NI后,各组细胞凋亡指数下降,差异有统计学意义(P＜0.01).氟可使SH-SY5Y细胞数量减少,形态变为圆形、不规则形,细胞存活率降低;低剂量(10-4、10-3 mmol/L) 7-NI组在相同视野下细胞数增加,高剂量(10-2 mmol/L)7-NI组细胞数明显减少,大部分细胞呈圆形或不规则形.结论 氟中毒所致细胞凋亡可能与NOS活力和NO含量升高有关,7-NI可降低细胞凋亡指数.
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低氧预适应对氧糖剥夺损伤SH-SY5Y细胞的保护作用
目的:观察低氧预适应(HPC)对氧糖剥夺(OGD)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的保护作用,并探讨其可能机制.方法:SH-SY5Y细胞随机分为4组:正常对照组:常规培养,不进行OGD处理;HPC处理组:将神经元放入低氧培养箱内(2％O2),30 min后立即取出,再恢复常氧培养,反复5次;OGD组:无糖培养基、低氧培养箱内(1％O2)处理细胞10 h,然后复氧复糖培养24h;HPC+OGD处理组:细胞HPC后,行OGD处理.通过形态学观察,MTT比色法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)漏出量判断细胞损伤的程度,原位末端标记(TUNEL)法检测凋亡水平,Western blot检测Caspase 3、低氧诱导因子1α(HIF-lα)的蛋白表达.结果:HPC可减轻OGD引起的SH-SY5Y细胞凋亡,降低LDH漏出量,明显增加OGD组SH-SY5Y细胞的活力(P＜0.05).Western blot显示HPC+ OGD组Cas-pase3蛋白的表达明显低于OGD组(P＜0.05);HIF-lα蛋白的表达明显高于OGD组(P＜0.05).结论:HPC对体外培养的SH-SY5Y细胞OGD损伤具有保护作用,其机制可能与上调HIF-lα蛋白有关.
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加兰他敏抗β淀粉样蛋白的神经保护机制研究
目的 观察加兰他敏(Gal)对β淀粉样蛋白(Aβ)损伤人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)后β淀粉样前体蛋白(APP)代谢通路的影响,探讨Gal的神经保护机制.方法 采用5μMAβ1-40作用于SH-SY5Y细胞制备体外细胞损伤模型,0.3μM加兰他敏对Aβ1-40处理的细胞进行干预并与正常细胞进行对照研究.倒置显微镜下观察细胞形态,应用噻唑蓝比色法(MTT)检测细胞活力,Western-blot技术定量检测各组APP,sAPPα,β-淀粉样前体蛋白剪切酶-1(BACE1)表达水平.结果 Aβ1-40孵育细胞24h之后,细胞损伤明显,存活率从95.78.±2.5%降到62.93±2.1%,与对照组相比差异显著(P<0.01);Western-blot显示细胞内BACE1表达增加,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα降低;在Aβ1-40孵育之前给予加兰他敏作用24h,细胞损伤程度减轻,细胞的存活率上升(85.26±5.3%)(P<0.01),细胞内BACE1表达较Aβ组下降,APP表达无明显改变,细胞分泌sAPPα升高.结论 加兰他敏通过抑制Aβ1-40诱导的APP的异常代谢发挥神经保护作用.
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石斛合剂减轻H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激的研究
目的:观察石斛合剂含药血清对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激的影响及可能的机制.方法:体外培养的SH-SY5Y细胞预先予以石斛合剂含药血清(10％)孵育24 h,加入终浓度为400 μmol·L-1的H2O2培养1h,采用MTT法测细胞存活率、酶法测细胞内SOD活力、MDA和GSH含量、流式细胞术测细胞凋亡情况等,以观察石斛合剂含药血清对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的影响.结果:与模型组比较,石斛合剂含药血清能明显提高受H2O2刺激的SH-SY5Y细胞的存活率(P＜0.05),降低MDA水平和提高SOD和GSH活力(P＜0.01),并减少因H2O2引起的神经细胞凋亡.结论:石斛合剂可保护H2O2引起的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤并抑制其凋亡.
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分泌表达神经保护短肽重组慢病毒对SK-N-SH细胞的保护作用
目的 构建分泌表达神经保护短肽NAP的重组慢病毒载体,观察重组慢病毒对APPsw转基因人神经母细胞瘤细胞(SK-N-SH)的保护作用.方法 采用PCR方法克隆融合基因NT4-NAP cDNA;磷酸钙沉淀法包装重组慢病毒Lent/NT4-NAP;平行包装含有报告基因EGFP的报告病毒;SK-N-SH细胞分为正常对照组、单纯APPsw转基因组、空慢病毒载体+APPsw转基因组和NT4-NAP慢病毒+APPsw转基因组,在倒置相差显微镜下观察形态学改变;MTT检测细胞增殖活力;Annexin V/PI法流式细胞术检测各组细胞凋亡和坏死情况.结果 基因测序证明克隆的NT4-NAPcDNA与实验设计完全一致;FACS检测重组病毒滴度为2×106 U/L;单纯APPsw转基因组,大量细胞出现凋亡及坏死(与正常对照组比较P＜0.01);NT4-NAP慢病毒+APPsw转基因组的细胞数量和活力明显较单纯APPsw转基因细胞改善(P＜0.01);FACS检测无论凋亡还是坏死细胞的比率保护组都明显低于加害组(P＜0.01).结论 成功构建了能够分泌表达NAP的重组慢病毒载体;重组病毒能够高效转染人神经母细胞瘤细胞;重组病毒表达的蛋白能对AD细胞模型起到很好的保护作用.
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乳清蛋白酶解物抑制神经母细胞瘤细胞钙超载作用研究
目的:探讨乳清蛋白酶解物通过抑制过氧化氢,减轻过氧化氢对神经母细胞瘤细胞损害的机制.方法:将培育的人神经母细胞瘤细胞随机分为四份,对照组:未添加H2O2以及乳清蛋白酶解物的正常培养基中的细胞;过氧化氢组:神经母细胞瘤细胞+50μLH2O2,乳清蛋白观察组:神经母细胞瘤细胞+50 μLH2O2+200 μg/mL乳清蛋白酶解物;乳清蛋白对照组:神经母细胞瘤细胞+200 μg/mL乳清蛋白酶解物,观察四组细胞存活和凋亡情况,以及细胞内钙离子和线粒体膜电位变化情况.结果:①细胞存活率对比上,过氧化氢组细胞存活率和凋亡率与其他三组相比,差异有统计学意义(F=24.62和32.82,P＜0.01);乳清蛋白观察组细胞存活率和死亡率与过氧化氢组相比差异有统计学意义(t=7.65和9.82,P＜0.05).②过氧化氢组钙离子荧光强度强,差异有统计学意义(Z=5.12,P＜0.05);而对照组和乳清蛋白对照组荧光强度明显低于过氧化氢组和乳清蛋白组,差异有统计学意义(Z=5.57和4.82,P＜0.05);乳清蛋白组荧光强度强于两对照组(Z=6.68,和4.15,P＜0.05),弱于过氧化氢组(Z=6.12,P＜0.05);③膜电位变化比较,正常对照组和乳清蛋白对照组荧光强度强,提示膜电位变化幅度小;过氧化氢组荧光强度弱,提示膜电位变化幅度大;乳清蛋白组荧光强度低于对照组而高于过氧化氢组,提示乳清蛋白酶解物能够阻止过氧化氢引起的线粒体膜电位改变.结论:乳清蛋白酶解物能够减少因过氧化氢诱导的神经母细胞瘤细胞内钙离子升高,减少线粒体内外膜电位差,从而抑制细胞凋亡.
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L-亚氨基乙基鸟氨酸与过量氟共培养对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞一氧化氮/内皮型一氧化氮合酶表达的影响
目的 探讨内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)特异性抑制剂L-亚氨基乙基鸟氨酸(L-iminoethyl ornithine hydrochloride,L-NIO)对氟致体外培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡、eNOS mRNA和蛋白表达以及一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性改变的影响.方法 将体外培养的SH-SY5Y细胞分为对照组、低氟组、高氟组、L-NIO组、低氟+L-NIO组、高氟+ L-NIO组,n=3.对照组加入与实验组等体积的培养液,低氟组和高氟组加入氟化钠(sodium fluoride,NaF)浓度分别为0.2、2.0 mmol/L,L-NIO组加入3μmol/L L-NIO,低氟+L-NIO组和高氟+L-NIO组分别加入0.2 mmol/L NaF和3μmol/L L-NIO、2.0 mmol/L NaF和3μmol/L L-NIO,培养时间为48 h.采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞中eNOS蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR)法检测细胞中eNOS mRNA表达水平,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,硝酸还原酶法和比色法检测细胞培养液中NO含量和NOS活性.结果 与对照组(1.000±0.026)比较,低、高氟组eNOS蛋白表达量(1.108±0.071、1.349±0.057)升高,L-NIO组(0.755±0.148)下降(P均＜0.05);与低氟组比较,高氟组升高,低氟+ L-NIO组(0.802±0.115)下降(P均＜0.05);与高氟组比较,高氟+L-NIO组(0.988±0.135)下降(P＜0.05).与对照组(1.000±0.018)比较,低、高氟组eNOS mRNA表达量(1.809±0.099、2.416±0.295)升高,L-NIO组(0.609±0.077)下降(P均＜0.05);与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组(1.040±0.034)下降(P均＜ 0.05);与高氟组比较,高氟+L-NIO组(1.233±0.152)下降(P＜0.05).与对照组[(1.66±0.07)％]比较,低、高氟组细胞凋亡率[(8.81±0.27)％、(17.60±0.20)％]升高,L-NIO组[(1.03±0.04)％]下降(P均＜0.05);与低氟组比较,高氟组升高,低氟+ L-NIO组[(6.03±0.10)％]下降(P均＜0.05);与高氟组比较,高氟+L-NIO组[(12.12±0.08)％]下降(P＜0.05).与对照组[(2.773±0.145) μmol/L]比较,低、高氟组细胞培养液中NO含量[(8.251±1.047)、(14.287±1.062) μmol/L]升高,L-NIO组[(1.648±0.155) μmol/L]下降(P均＜0.05);与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组[(4.622±0.252)μmol/L]下降(P均＜0.05);与高氟组比较,高氟+L-NIO组[(7.899±0.385) μmol/L]下降(P＜0.05).与对照组[(0.507±0.041)U/ml]比较,低、高氟组细胞培养液中NOS活性[(0.772±0.032)、(2.258±0.062)U/ml]升高,L-NIO组[(0.346±0.015)U/ml]下降(P均＜0.05);与低氟组比较,高氟组升高,低氟+L-NIO组[(0.637±0.026)U/ml]下降(P均＜0.05);与高氟组比较,高氟+ L-NIO组[(1.161±0.071)U/ml]下降(P＜0.05).结论 过量氟可导致SH-SY5Y细胞eNOS蛋白和mRNA过度表达以及细胞凋亡率上升,细胞培养液中NO含量增多以及NOS活性增强,加入L-NIO与氟共培养后可拮抗氟对SH-SY5Y细胞的损伤,起到一定的神经保护作用.
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维生素E、维生素C、牛磺酸对苯并[a]芘致SH-SY5Y细胞能量代谢损伤的影响
[目的]观察维生素E、维生素C、牛磺酸对苯并[a]芘(BaP)暴露引起人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)能量代谢损伤的影响.[方法]分别用DMSO、BaP (1μmoL/L)、BaP (1μmoL/L)+维生素E(S0μmoL/L)、BaP (1 μmoL/L)+维生素C (100μmoL/L)、BaP (1μ moL/L)+牛磺酸(100 μmoL/L)处理SH-SY5Y细胞24h后,用MTT法检测细胞存活率,ROS活性氧检测试剂盒检测细胞内ROS水平,细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒检测细胞内MDA含量,超氧化物歧化酶(SOD)分型测试盒检测细胞内SOD活性,Seahorse XFp细胞能量分析仪检测细胞线粒体呼吸功能和糖酵解功能.[结果]BaP染毒组细胞存活率(84.2％±1.2％)、SOD活性[(60.19±1.02)U/mg]低于溶剂对照组[100％±3.74％、(67.37±0.78) U/mg] (P＜0.05),ROS水平(60.73％±3.15％)和MDA含量[(0.837±0.104) μmol/g]则高于溶剂对照组[31.27％±1.40％、(0.382±0.083) μmol/g] (P＜0.0B).BaP染毒组基础有氧呼吸速率[(2.64±0.43) pmol/min]、ATP偶联的有氧呼吸速率[(2.09±0.32) pmol/min]、有氧呼吸大值[(3.42±0.03) pmol/min]、有氧呼吸储备值[(0.78±0.44)pmol/min]均低于溶剂对照组[(4.89±0.43、4.16±0.24、7.06±0.11、2.18±0.35)pmol/min](P＜0.05),质子漏耗氧速率[(0.55±0.16) pmol/min]、糖酵解水平[(3.54±1.02)mpH/min]、糖酵解大值[(5.94±0.47) mpH/min]、糖酵解储备值[(2.40±0.61)mpH/min]与溶剂对照组[(0.73±0.27) pmol/min、(2.71±0.66) mpH/min、(5.75±0.65) mpH/min、(3.04±0.19)mpH/min]相比,差异无统计学意义(P＞0.05).维生素E、维生素C、牛磺酸干预组细胞存活率(90.2％±1.1％、91.9％±3.1％、98.2％±2.1％)、SOD活性[(67.28±0.43)、(66.23±0.70)、(65.47±1.17)U/mg]明显高于BaP染毒组[84.2％±1.2％、(60.19±1.02) U/mg] (P＜0.05),细胞内ROS水平(34.53％±1.96％、37.07％±2.42％、38.77％±2.31％)、MDA含量[(0.477±0.095)、(0.544±1.09)、(0.558±0.152)μmol/g]则低于BaP染毒组[60.73％±3.15％、(0.837±0.104) μmol/g] (P＜0.05).维生素E、维生素C、牛磺酸干预组基础有氧呼吸速率[(4.30±0.36)、(4.44±0.35)、(4.42±0.51) pmol/min],ATP偶联的有氧呼吸速率[(3.45±0.20)、(3.70±0.19)、(3.60±0.34) pmol/min],有氧呼吸大值[(5.53±0.03)、(5.52±0.04)、(5.56±0.02) pmol/min]均高于BaP染毒组[(2.64±0.43)、(2.09±0.32)、(3.42±0.03) pmol/min](P＜0.05),有氧呼吸储备值[(1.23±0.35)、(1.08±0.31)、(1.14±0.50) pmol/min]与BaP染毒组[(0.78±0.44) pmol/min]相比,差异无统计学意义(P＞0.05).糖酵解压力测试结果显示,5组间3项指标的差异均无统计学意义(P＞0.05).[结论]BaP暴露可导致SH-SY5Y细胞氧化损伤,降低线粒体呼吸功能,维生素E、维生素C、牛磺酸对BaP暴露引起的能量代谢损伤具有一定的保护作用.
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苯并[α]芘对人神经母细胞瘤细胞能量代谢的影响
[目的]研究苯并[α]芘(BaP)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞能量代谢的影响,进一步探讨BaP的神经毒性.[方法]不同浓度BaP染毒SH-SY5Y细胞24h,采用MTI法检测细胞活力;细胞丙二醛(MDA)测定试剂盒测定细胞内MDA含量;超氧化物歧化酶(SOD)分型测试盒测定细胞内锰(Mn)-SOD含量;Seahorse XFp细胞能量分析仪检测细胞耗氧率(OCR)及胞外酸化率(ECAR).[结果]随着BaP染毒浓度的增大,细胞活力明显下降(P趋势＜0.01);随着BaP染毒浓度的增大,细胞内MDA水平升高(P趋势＜O.01),Mn-SOD水平降低(P趋势＜0.01),1.0、10.0、100.0 μmol/LBaP组细胞内MDA含量明显高于对照组,Mn-SOD含量明显低于对照组(P＜0.05);随着BaP染毒浓度的增大,细胞的基础有氧呼吸、ATP偶联有氧呼吸速率、有氧呼吸大值、糖酵解水平、糖酵解大值及糖酵解储备值均呈下降趋势(P趋势＜0.01),各浓度组基础有氧呼吸、ATP偶联有氧呼吸速率明显低于对照组(P＜0.05);10.0、100.0 μmol/L BaP组有氧呼吸大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平、糖酵解大值及糖酵解储备值明显低于对照组(P＜0.05).不同浓度BaP处理组MTT光密度值及Mn-SOD含量与基础有氧呼吸、ATP偶联有氧呼吸速率、有氧呼吸大值、有氧呼吸储备值、糖酵解水平、糖酵解大值及糖酵解储备值均呈正相关(P＜0.05),细胞内MDA含量与各细胞生物能量参数均呈负相关(P＜0.05).[结论] BaP造成SH-SY5Y细胞氧化损伤,降低线粒体呼吸功能,较高浓度时损伤有氧呼吸储备能力及糖酵解功能.
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帕金森病体外细胞模型的研究进展
帕金森病作为长期困扰中老年人的重大疾病,广泛受到人们的关注.在帕金森病的研究过程中,由于动物实验的周期长、消耗大,因而体外细胞模型越来越多的被用来进行相关病理、生理及药物筛选研究.而在体外细胞模型的选择上,不同造模剂各有特色,而且使用的细胞系不同,也使模型表现出不同的特点,并终影响研究结果.
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蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病转基因细胞模型氧化应激损伤保护作用的研究
目的 探讨蝙蝠葛碱对阿尔茨海默病(AD)转基因细胞模型氧化应激损伤的保护作用.方法 将质粒APPswe转染入SH-SY5Y细胞中,构建过表达APP的AD细胞模型,检测不同蝙蝠葛碱浓度下细胞存活率、丙二醛(MDA)含量及COX-2蛋白表达的差异.结果 随着给药浓度的增加,细胞存活率逐步增加,MDA含量逐步降低,其中空白对照组、20或10倍稀释蝙蝠葛碱预处理组与模型组差异有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01),10倍稀释蝙蝠葛碱预处理组与100、50倍稀释蝙蝠葛碱预处理组差异有统计学意义(P ＜0.05或P＜0.01);COX-2蛋白表达量随着给药浓度增加而逐渐下降.结论 蝙蝠葛碱对AD转基因细胞模型的氧化应激损伤具有一定的抑制作用,且呈现出剂量效应.
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PTD-SOD对Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护和修复作用研究
目的 研究PTD-SOD对Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护和修复作用.方法 建立Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞缺氧损伤模型,采用MTT法检测融合蛋白PTD-SOD对细胞存活率的影响,LDH释放分析检测PTD-SOD对细胞损伤后的保护作用及损伤后细胞内氧化与抗氧化水平的变化.结果 对Na2S2O4诱导的SH-SY5Y细胞缺氧损伤,MTT活性检测、LDH分析及氧化与抗氧化水平分析都表明PTD-SOD能明显提高细胞存活率和细胞内抗氧化能力.结论 PTD-SOD融合蛋白能保护Na2S2O4诱导缺氧损伤的SH-SY5Y细胞,具有抑制细胞死亡,改善损伤细胞内抗氧化能力.
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27-羟基胆甾醇诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡的调控机制
目的 探讨27-羟基胆甾醇(27-OHCH)诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)凋亡的调控机制.方法 不同浓度(0、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0μM)的27-OHCH作用SH-SY5Y细胞,采用CCK-8法检测细胞存活率,在光学显微镜下观察27-OHCH处理组、添加苏氨酸蛋白激酶(AKT)抑制剂(LY294002)的27-OHCH处理组细胞形态变化,Western blot法检测磷酸化AKT (p-AKT)、cleaved-caspase-9蛋白表达,Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 给药24h,12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH处理组SH-SY5Y细胞存活率均明显降低(均P＜0.05);给药48h,不同浓度(3.125～50.0μM)27-OHCH处理组SH-SY5Y细胞存活率均明显降低(均P＜0.05).在显微镜下观察发现,27-OHCH能诱导SH-SY5Y细胞凋亡,使细胞数量减少,而LY294002能减弱27-OHCH诱导的细胞毒效应.随着27-OHCH处理组浓度的增加,SH-SY5Y细胞内p-AKT (Ser 473)、cleaved-caspase-9(37/35kD)表达明显增强;经LY294002预作用后,不同浓度(0～50.0μM)27-OHCH处理组p-AKT(Ser 473)表达均受抑制,而12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH处理组cleaved-caspase-9蛋白表达变化不明显.给药48h,12.5、25.0μM 27-OHCH处理组均能引起SH-SY5Y细胞凋亡效应,而LY294002预作用2h能逆转细胞凋亡效应(均P＜0.05).结论 27-OHCH可通过AKT信号通路诱导SH-SY5Y细胞凋亡.
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帕金森病细胞模型的构建及氨基酸表达观察
目的 建立帕金森病(PD)人神经母细胞瘤细胞模型,并筛选PD细胞中的氨基酸标志物.方法 将人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y分为正常组、溶媒组、鱼藤酮组.鱼藤酮组分别加入0.15、0.25 μmol/L的鱼藤酮,溶媒组加入二甲基亚砜(DMSO),正常组不加药物.分别于给药24、48 h后采用MTT法测算细胞存活率,倒置显微镜观察细胞形态,选择对细胞存活、形态影响较小的鱼藤酮作用浓度及作用时间(0.15 μmol/L、24 h),采用Western blotting法检测SH-SY5Y细胞中的α-突触核蛋白以验证PD模型.采用高效液相色谱法检测PD细胞中的谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys),对鱼藤酮组和溶媒组差异有统计学意义的氨基酸进入偏小二乘判别分析,选择P<0.05且变量重要性投影值(VIP)>1的氨基酸为PD的标志物.结果 鱼藤酮组细胞中α-突触核蛋白相对表达量高于溶媒组(P均<0.05),表明SH-SY5Y细胞PD模型制作成功.给药24 h时,鱼藤酮组细胞中Glu、Ser、Gln、His、Gly、Pro、Phe、Ile、Leu、Lys水平低于溶媒组(P均<0.05);给药48 h时,鱼藤酮组除Gln外,其余11种氨基酸水平均低于溶媒组(P均<0.05).筛选氨基酸标志物为Glu、Ser、Gly、Pro(给药24 h时VIP值分别为1.016、1.016、1.016、1.009,给药48 h时VIP值均为1.001).结论 利用鱼藤酮诱导成功建立了PD细胞模型,筛选出Glu、Ser、Gly、Pro可能为PD的潜在标志物.
