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应用抑制性消减杂交技术鉴定肿瘤转移抑制相关基因
目的克隆与肿瘤转移抑制相关的基因, 探讨成骨肉瘤转移的分子机理.方法采用抑制性消减杂交技术构建了人成骨肉瘤低转移细胞株SOSP-9607的消减文库,对部分克隆进行了测序和同源性分析,用Northern杂交及反转录PCR技术证实了克隆的表达情况.结果在低转移细胞株SOSP-9607中高表达的克隆中有2个克隆与人端粒结合因子2(telomeric repeat binding factor 2,TERF2)同源.Northern杂交及反转录PCR证实这个基因只在低转移细胞中表达,而在高转移人成骨肉瘤细胞株SOSP-M和裸鼠肺转移结节中均未表达.结论 TERF2可能在维持肿瘤细胞自身相对稳定、抑制骨肉瘤演进中起重要作用.
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抑制性消减杂交技术及其在肺癌研究中的应用
1 SSH技术及其发展肿瘤的发生发展与多种基因的异常表达及相互作用相关,而这些基因的差异表达是决定肿瘤表型多样性的分子基础.对肿瘤与正常组织之间、肿瘤不同病理学类型之间及同一病理学类型的不同阶段之间进行差异表达基因的克隆与功能研究,是了解各种肿瘤发生发展过程的重要环节,不仅可探究造成两种表型差异的遗传原因,而且对肿瘤的诊断与治疗具有重要意义,为此人们建立了一系列研究基因差异表达的方法.
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应用抑制性消减杂交技术克隆人肺鳞癌差异性表达基因
目的克隆人肺鳞癌肿瘤差异性表达基因.方法应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建人肺鳞癌cDNA消减杂交文库,筛选后挑选阳性克隆进行测序,并在Gen Bank数据库中进行同源性比较,后经RT-PCR验证.结果成功克隆10个差异基因片段,其中2个为新基因(GenBank登录号分别为:C20:AF363068;C34:AY032661).结论抑制性消减杂交技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法.
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舌鳞癌中高醛脱氢酶活性细胞相关基因的生物信息学分析
目的:构建舌鳞癌Tca8113细胞中高醛脱氢酶活性(high aldehyde dehydrogenase activity,ALDHhigh)细胞特异性表达基因cDNA文库并进行相应的生物信息学分析.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术,以ALDHhigh细胞RNA为测试方、低醛脱氢酶活性(ALDHlow)细胞RNA为驱动方,构建文库；应用BLAST、Gene Set Analysis Toolkit V2等软件进行生物信息学分析.结果:随机挑选20个集落进行PCR分析,克隆片段均匀分布在200 bp～ 700 bp,无假阳性克隆,成功构建文库；对120个克隆测序并进行BLAST分析,得到27个差异表达基因；功能聚类发现部分与细胞增殖、生长繁殖、再生等生物行为相关.结论:成功构建的ALDHhigh细胞特异性表达基因cDNA文库,为下一步找出ALDHhigh干细胞特性相关基因提供帮助.
关键词： 人舌鳞癌Tca8113 抑制性消减杂交技术 肿瘤干细胞 醛脱氢酶 生物信息学 -
哮喘发作与细胞骨架重建相关基因的差异表达
目的:研究外周血嗜酸性粒细胞(EOS)在哮喘发作时与细胞骨架相关基因的差异表达.方法:应用Super SMART cDNA synthesis技术从总RNA合成足量的双链cDNA. 经液相杂交消减两组共同序列,以抑制性PCR方式扩增差异表达序列. 构建上调与下调cDNA文库,菌落PCR扩增差异片段,应用差异筛选技术进一步鉴定差异表达基因并测序,结果通过核酸数据库进行同源性比较.结果:构建了高效的上调与下调消减cDNA文库,经鉴定及同源性分析有6个与细胞骨架重建有关,包括上调基因slingshot磷酸酶(SSH-2L),蛋白磷酸酶1β亚型(PP1Cβ),无功能糖基转移酶样蛋白(DOCK-8),蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型6 (PTPN6)与非受体型12(PTPN12);下调基因,肌凝蛋白调节轻链结合蛋白(MIR).结论:这些骨架重建相关基因的差异表达可能参与了哮喘发作,进一步进行功能研究可能为哮喘治疗提供新的作用靶点.
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应用抑制性消减杂交技术筛选成骨肉瘤转移相关基因
目的: 探讨与人成骨肉瘤转移相关的基因表达变化. 方法: 通过抑制性消减杂交技术从一对同一亲本、转移表型不同的人成骨肉瘤细胞株中分别提取细胞总RNA,筛选差异表达基因并测序,将结果与核酸数据库进行同源性比较. 结果: 获得12个在低转移成骨肉瘤中高表达的、均与已知的人类基因片段有很高同源性的核甘酸片段. 结论: 差异表达的基因可能与成骨肉瘤细胞转移生物学特性呈密切相关,特别是在维持肿瘤细胞自身稳定、防止转移中起重要作用.
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抑制性消减杂交构建凋亡肝癌细胞差异表达cDNA文库
目的 应用抑制性消减杂交技术构建肝癌细胞凋亡消减杂交cDNA文库 ,以期克隆肝癌细胞凋亡相关基因. 方法 用三氧化二砷诱导人肝癌HCC-9204细胞凋亡,提取poly A+ RNA,反转录合成cDNA,消化成短片段后分成两组,分别与 两种不同的接头连接,再与普通肝癌细胞的cDNA进行两次杂交及两次抑制性PCR扩增,将PCR 产物与PT-Adv线性载体连接,转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆进行酶切鉴定, 反向Northern blot分析差异基因的可靠性. 结果 成功地构建了具有高消 减效率的人肝癌凋亡细胞cDNA文库,随机挑取200个克隆制备质粒并酶切分析,其中83.5%的 克隆均具有100～600 bp左右的插入片段. 随机选取30个插入片段,分别以未凋亡和凋亡的肝 癌细胞cDNA为探针,进行Reverse Northern Blot,其中21个被证明为差异表达的细胞凋亡 相关基因cDNA片段. 结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了人肝癌凋 亡细胞cDNA消减文库,为大批量筛选、克隆肝癌细胞凋亡相关的未知新基因奠定了基础,有 助于了解细胞凋亡的分子机制.
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应用抑制性消减杂交技术筛选HBxAg蛋白结合蛋白XBP1的上调基因
目的 应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBxAg蛋白结合蛋白XBP1,为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆XBP1蛋白反式激活的靶基因.方法 以XBP1表达质粒pcD-NA3.1(-)-myc-his(A)-XBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)-myc-his(A)为对照；制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并合成cDNA,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别衔接两种不同接头,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次PCR反应,产物与T/A克隆载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR鉴定后进行测序及同源性分析.结果 成功构建人XBP1蛋白反式激活相关基因差异表达的cDNA.扩增后得到80个200～1 000 bp插入片段的克隆,随机挑选其中30个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得28个已知编码序列基因和2个未知的新基因.结论 XBP1在肝细胞内表达后能够上调HepG2细胞中许多不同基因表达的变化,这些基因与细胞信号转导、细胞增殖与分化、免疫应答、能量代谢、细胞凋亡、肿瘤发生等生物过程密切相关.
