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兔外周血与骨髓源性内皮祖细胞培养鉴定及生物学特性的研究
目的:探索并建立兔内皮祖细胞(EPCs)的体外培养、鉴定方法.方法:采用密度梯度分离法分别从兔外周血和骨髓中分离出单个核细胞,接种于预包被明胶的培养瓶,并应用培养基(EBM-2)诱导培养,诱导分化为EPCs；在倒置显微镜下观察两种源性细胞生长过程；台盼蓝法测定细胞传代成活率；通过绘制生长曲线法、MTT法、DNA周期检测比较两种源性获得的EPCs增殖情况；采用免疫荧光染色观察EPCs相关抗原CD34、CD31、CD133及vWF因子的表达.结果:两种源性EPCs均于培养3～4d完全贴壁,呈克隆样生长,7 ～9d形成类似成熟血管内皮细胞形态,细胞数量逐渐增多,细胞成活率均为95％.两种源性获得的第2代细胞生长曲线近似“s”形、MTT法显示3～5d细胞增殖较明显,外周血源性EPCs G0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为96.48％和3.52％,骨髓源性EPCsG0-G1期和S+G2+M期所占比例分别为97.11％和1.84％.第2代EPCs进行免疫荧光鉴定结果显示:两种源性内皮祖细胞均阳性表达CD34、CD133、vWF因子,CD31弱阳性表达.结论:两种源性的EPCs均可高效获得且在体外稳定培养.与传统的骨髓源性EPCs相比较,从外周血源获得的EPCs是一种可靠、简便的培养方法,为组织工程学提供理想的细胞来源.
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骨髓源性内皮祖细胞与内皮细胞共培养促进其向成熟内皮细胞分化的研究
目的:探讨共培养的内皮细胞对内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化的影响.方法:分离1～2个月龄,SD大鼠股骨髓,个核细胞(MNCs),MNCs,Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染鉴定内皮细胞的特性.应用贴块法培养大鼠腹主动脉的内皮细胞,vWF免疫组化染色进行鉴定.采用Transwell培养板,上、下室分别加入内皮祖细胞和内皮细胞,15％胎牛血清的NO.2 DMEM/F12培养液培养14 d,倒置相差显微镜观察培养内皮祖细胞的形态.RT-PCR检测eNOS、vWF mRNA,流式细胞术检测CD31及KDR的表达.结果:荧光双染显示培养的单个核细胞具有内皮祖细胞特性;共培养的内皮祖细胞呈短梭型、铺路石状,培养至4 w时有复杂的网状结构形成.RT-PCR检测显示,eNOS及vWF mRNA表达均较对照组显著增加(P＜0.05).流式细胞术分析表明,共培养组的内皮祖细胞CD31及KDR的表达,也显著高于对照组(分别为P＜0.05及P＜0.01).结论:与内皮细胞共培养可促进内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化.
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白细胞介素-12基因缺陷促进内皮祖细胞浸润改善缺血再灌注后心肌损伤的研究
目的:探讨白细胞介素-12 (IL-12)调控小鼠心肌缺血再灌注损伤(IRI)的作用机制.方法:复制小鼠心肌IRI模型,分成四组:野生型(WT)假手术组;白细胞介素-12p35亚基(IL-12p35)基因缺陷假手术组;WT手术组;IL-12p35基因缺陷手术组.超声检测心脏结构及功能;采用Masson三色特殊染色法检测组织内胶原沉积;TUNEL检测心肌细胞凋亡;免疫组化染色及qRT-PCR检测内皮祖细胞(EPC)招募相关的趋化因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)表达以及EPC细胞表面趋化因子受体(CXCR4)和血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)表达;流式细胞术检测IRI后梗死部位EPC数量.结果:缺血再灌注术后14d,与对照组相比,IL-12p35基因缺陷小鼠的心脏射血分数明显升高[WTvs.IL-12p35基因缺陷:(48.7±5.9)vs.(55.2±6.7)％,P＜0.05],心功能显著改善;心肌纤维化程度明显减轻(P＜0.05);术后1d,IL-12p35缺陷小鼠心肌细胞凋亡数量较对照组,差异无统计学意义;术后7d,IL-12p35基因缺陷小鼠心脏中趋化因子GM-CSF、EPC细胞表面受体CXCR4和VEGFR表达较对照组显著增加(P＜0.05),干扰素-γ(IFN-γ)表达较对照组减少(P＜0.05);且与对照组相比,IRI后梗死部位EPC数量明显升高(P＜0.05).结论:IL-12基因缺陷表现出明显的抗心肌IRI的作用,其机制是GM-CSF表达增加促进内皮祖细胞(EPC)浸润,从而促进了血管生成和抑制心力衰竭.
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拉西地平对原发性高血压患者内皮祖细胞内皮修复能力的影响
目的 探讨拉西地平对高血压患者外周血内皮祖细胞(EPCs)体外功能活性及在体再内皮化能力的影响.方法 选择初发的原发性高血压患者和性别、年龄匹配的健康志愿者各10例,分离其外周血单个核细胞诱导分化成EPCs.培养7天后用不同浓度的拉西地平10、100以及1000nmol/L预处理,体外观察EPCs的迁移、黏附功能;建立裸小鼠颈动脉损伤模型,分别移植未处理与100nmol/L的拉西地平预处理的高血压病人外周血EPCs,在体观察EPCs的修复效能.用Realtime RT-PCR及Western-blot检测EPCs表面基因和蛋白的表达情况,探讨拉西地平影响内皮化的分子机制.结果 不同浓度的拉西地平预处理高血压病人外周血EPCs,体外迁移和黏附功能较未处理组明显增强,100nmol/L为显著(p＜0.05);100nmol/L的拉西地平预处理的EPCs在体再内皮能力较对照组显著增加(p＜0.01).基因及蛋白水平检测显示,不同浓度的拉西地平处理后,EPCs表面的CXCR4表达增加,100nmol/L为显著(p＜0.001).结论 拉西地平明显改善高血压病人EPCs血管损伤修复能力,可能与CXCR4有关.
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内皮祖细胞临床研究进展
内皮祖细胞(EPCs)是一种能分化为血管内皮细胞的前体细胞.目前发现成人体内存在EPCs,它可以从骨髓动员到外周血,分化为成熟的内皮细胞,并整合到血管损伤部位,参与血管修复.近文献显示:循环EPCs的数量和功能可以作为内皮损伤的标志;在肢体缺血、心肌梗塞和中风治疗中具有重要作用.本文将对EPCs在临床研究中的应用作一综述.
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内皮祖细胞捕获支架治疗冠心病的研究进展
经皮冠状动脉介入治疗是目前冠心病的重要治疗手段.支架置入术后再内皮化延迟与支架内再狭窄和血栓形成密切相关.随着内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)研究的深入,EPC捕获支架诞生了.理论上其可以捕捉血液中的EPC,使其附着在支架上并分化为成熟的内皮细胞以加速局部内皮化,达到防止支架内再狭窄和血栓形成的目的.然而目前的研究发现EPC捕获支架的再狭窄率高.但是应用EPC捕获支架抗血小板治疗的时间短,对于不能坚持双联抗血小板的患者来说,EPC捕获支架有一定的优势.随着对EPC研究的不断深入及支架制作工艺的逐步提高,EPC捕获支架有希望成为冠心病治疗的又一利器.
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内皮祖细胞的动员及影响因素
内皮祖细胞是一类能分化成血管内皮细胞的前体细胞,在生后成人血管发生(vasculogenesis)中起着重要的作用.从骨髓刺激内皮祖细胞的动员,增加循环内皮祖细胞的数量,是促进血管新生(neovascularization)的一种有效措施,因此对动员影响因素及其机制的研究具有重要临床意义.
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内皮祖细胞捕获支架的困惑与希望
药物洗脱支架显著减少了支架内再狭窄的发生,但同时过度的抑制了支架局部的内皮层的自然愈合,影响了其远期疗效.随着内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的研究进展,通过动员外周血EPCs到血管局部并修复损伤内皮成为抗再狭窄的新策略之一,由此理论产生的EPCs捕获支架正成为一种颇具前景的新型功能化支架.然而目前的EPCs捕获支架仍不成熟,其抗再狭窄功能没有充分体现,但随着对EPCs分化机制和调控的研究逐步深入,以及支架的生物工程化制作工艺的不断改善,EPCs捕获支架作为一种具有加速内皮修复功能的新型支架,在冠心病的介入治疗中将占有重要地位,并将启发人们研制更多的功能化支架.
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人和大鼠内皮祖细胞培养及其生长特性的比较
目的 建立人内皮祖细胞(hEPCs)离体培养的方法,探讨培养条件,观察细胞生长状态、形态.xd同时行大鼠EPCs(rEPCs)培养.建立hEPCs和rEPCs培养体系,比较两者不同的生长条件和生长状态.方法:取人脐带血80-120ml/袋,先分离单个核细胞,后使用磁珠细胞分选法(MACS),分选出CD 133+/VEGFR2+的细胞,进行流式细胞检测,发现双阳性细胞占48.79％.用差速贴壁法培养5-9天,倒置相差显微镜观察细胞形态并照相、免疫荧光染色后荧光显微镜下观察照相.取大鼠骨髓,冲洗骨髓腔,离心沉淀出细胞,差速贴壁培养法培养、观察.结果:(1) hEPCs在普通光镜下呈索条状、卵圆形.(2)细胞吞噬DiI-acLDL、UEA染料后可在荧光显微镜下特异显色,证明细胞有吞噬功能,推断为hEPCs.(3) CD133+/VEGFR2+的hEPCs细胞,占使用MACS筛选后细胞比例为48.79％.(4)从骨髓中分离出的rEPCs生长活力明显优于hEPCs.结论:(1)该方法培养的hEPCs和rEPCs生长活性好,在普通光镜下呈索条状、卵圆形或铺路石样；(2) hEPCs在细胞数量上可不少于rEPCs,从骨髓中培养出的rEPCs增殖力优于脐血来源的hEPCs.此实验比较并完善了两种不同来源内皮祖细胞培养的方法学及其生长特征,有利于根据不同的细胞培养特性来选择应用于内皮祖细胞的实验研究.
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生理性雌激素对骨髓源性内皮祖细胞迁移功能的影响
目的 研究生理性雌激素对骨髓源性内皮祖细胞(BM-EPCs)迁移功能的影响及其机制.方法 雌性BALB/C小鼠随机分成卵巢切除组、假手术组和正常组.ELISA法检测各组血清雌激素浓度.取胫骨和股骨骨髓,培养、鉴定BM-EPCs.Transwell小室检测各组BM-EPCs经或未经CXCR4抑制剂AMD3100处理后向基质细胞衍牛因子-1α(SDF-1α)的迁移功能.RT-PCR和流式细胞术检测各组BM-EPCs CXCR4的表达.结果 卵巢切除组血清雌激素浓度明显低于假手术组和正常组(P<0.01).卵巢切除组BM-EPCs向SDF-1α迁移的数量明显低于假手术组和正常组(P<0.01).AMD3100明显抑制BM-EPCs向SDF-1 α的迁移功能.卵巢切除组BM-EPCs CXCR4的表达明显低于假手术组和正常组(P<0.01).结论 生理性雌激素通过调节BM-EPCs CXCR4的表达而增强其迁移功能.
关键词： 雌激素 内皮祖细胞 迁移 CXCR4 基质细胞衍生因子-1α -
高血压对内皮祖细胞再内皮化能力的影响
目的:探讨高血压对内皮祖细胞粘附、迁移功能及再内皮化能力的影响.方法:选择初发的原发性高血压患者和性别、年龄匹配的健康志愿者各10例,分离其外周血的单个核细胞诱导分化成内皮祖细胞,并通过免疫荧光标记等方法进行形态学观察和鉴定.培养7天后分别观察2组内皮祖细胞的粘附和迁移能力.建立裸鼠颈动脉内皮损伤模型,分别移植健康志愿者与高血压患者的内皮祖细胞,观察损伤血管再内皮化情况.结果:外周血单个核细胞在体外诱导分化成为内皮祖细胞,ac-LDL吞噬及lectin抗体荧光标记双阳性.高血压患者组内皮祖细胞的粘附与迁移能力均明显低于健康志愿者组,裸鼠颈动脉内皮损伤修复面积亦小于健康志愿者组.结论:高血压患者循环内皮祖细胞粘附、迁移功能及再内皮化能力的下降,提示内源性血管修复能力下降可能是高血压血管内皮损伤的重要机制.
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急性心肌梗死患者急性期外周血内皮祖细胞和血清中血管内皮生长因子水平的意义
目的 探讨急性心肌梗死患者(AMI)外周循环中内皮祖细胞(EPCs)数目和内皮生长因子(VEGF)水平的变化意义.方法 入选35例心肌梗死患者(实验组)和30例健康人(对照组),分别在AMI患者入院时以及治疗两周后采血,用密度梯度离心法获得单个核细胞(MNCs),用CD34、VEGF和AC133标定EPCs,用流式细胞仪(FCM)检测外周血中EPCs细胞数目,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测患者血清中VEGF水平以及高敏C反应蛋白水平(hs-CRP).结果 AMI患者入院时EPC数目以及血清中VEGF以及CRP水平明显高于对照组(p＜0.05),在治疗两周后患者外周血中EPCs和VEGF仍高于正常水平(p＜0.05),但是CRP已经恢复到正常水平.入院时患者EPCs数目和患者血清中hs-CRP水平呈正相关(r=0.5898,p=0.002);治疗两周后EPCs数目和患者血清中VEGF水平相关性(r=0.5915,p=0.0002).结论 AMI患者早期循环中EPCs数量增加可能与急性炎症反应有关,而两周后EPC的数目增加可能VEGF对EPCs的动员有关,均有利于心梗部位的修复.
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内皮祖细胞促动脉内皮损伤修复的研究
目的 评价骨髓源性内皮祖细胞(progenitor endothelial cells,EPCs)移植促动脉损伤内皮修复的效果.方法 将菲立磁(superparamagnetic iron oxide, SPIO)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)双标记的EPC局部注入损伤颈动脉段腔内.术后1 d、7 d和28 d行磁共振(magnetic resonance imaging, MRI)扫描、组织学检查及内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)检测.结果 MRI扫描发现移植部位出现低信号区.移植组HE、普鲁士蓝、vWF免疫组化染色、GFP荧光、偶氮蓝(Evans blue)染色均提示EPC可粘附于内膜损伤处,并随时间分化为内皮细胞;同时eNOS表达随时间变化而增多.结论 菲立磁标记内皮祖细胞可促进动脉损伤内皮的修复,并可为MRI示踪.
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2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的变化
目的 观察2型糖尿病(DM)患者外周血内皮祖细胞(EPCs)数量和功能的改变.方法 选择2型DM患者16例和对照组19例,密度梯度离心法收集外周血单个核细胞(MNCs),诱导分化培养7 d后.荧光染色和流式细胞术分别鉴定贴壁细胞为EPCs.采用二苯基四氮唑嗅盐(MTT)比色法、黏附能力测定实验和体外血管生成实验检测EPCs的增殖能力、黏附能力和体外血管生成能力.结果 2型DM患者外周血EPCs数量明显减少[(3.1±1.2)×105]:[(3.9±1.1)×105],P＜0.05.且2型DM患者外周血EPCs黏附能力[(50±15):(60±11)细胞/×200视野,P＜0.05],增殖能力[(0.170±0.056):(0.225±0.071)OD值,P＜0.05],体外血管生成能力均明显受损.结论2型DM患者外周血EPCs的数量减少,且其增殖、黏附和血管生成能力受损.
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壳聚糖/肝素层层自组装涂层与CD133+内皮祖细胞生物相容性的实验研究
目的 研究壳聚糖/肝素层层自组装涂层对CD133+内皮祖细胞的黏附、增殖相关基因表达的影响,并从分子生物学角度探讨其作为促内皮修复功能药物洗脱支架涂层材料的可行性.方法 (1)分离人脐血单个核细胞,免疫磁珠分选CD133+内皮祖细胞;(2)制备壳聚糖/肝素层层自组装涂层,1%明胶涂层以及玻璃对照皿,接种并培养分选所得内皮祖细胞;(3)免疫荧光鉴定内皮祖细胞;(4)抽提总RNA,RT-PCR法比较不同培养介质中细胞的eNOS、VE-cadherin、KDR、PECAM-1、Sirtuin-1、Thrombomodulin等基因的表达差异.结果 (1)重力梯度离心及磁珠分选法所得CD133+内皮祖细胞纯度较高(92.88%±0.51%(n=4),在VEGF诱导下能较好的分化为内皮细胞;(2)eNOS、VE-cadherin、KDR、PECAM-1和Sirtuin-1在壳聚糖/肝素层层自组装涂层组表达丰度较玻璃对照组显著增高(P<0.05),与明胶组差异不明显,Thrombomodulin在壳聚糖涂层表达丰度较明胶组、玻璃组表达均增高(P<0.05)结论 壳聚糖涂层能促进内皮祖细胞的黏附、增殖,生物相容性好,为理想的生物材料.
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线粒体ALDH2缺失对小鼠骨髓源性内皮祖细胞功能的影响
目的 研究线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)缺失对体外培养的小鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)生长状态及功能的影响.方法 分别取C57BL/6小鼠(WT)和相同背景来源的Aldh2基因缺失(Aldh2-/-,KO)小鼠的股骨和胫骨,PBS冲洗获得骨髓细胞组份,密度梯度离心收集单个核细胞白膜层,并进行细胞计数,同时观察不同基因型来源的细胞在不同的培养体系及不同时间点的生长特点,采用乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)吞噬实验和荆豆凝集素(FITC-UEA-1)结合实验验证EPC的状态和功能.结果 Aldh2-/-小鼠的骨髓单个核(BMNCs)数目与野生型小鼠相比显著降低(p＜0.05,n=7),但是成集落能力两组之间无差异.在M199培养基中培养不同基因型来源的BMNCs时,细胞呈链条状结构,而在EGM-2培养基中培养时,细胞呈集落式生长.培养第十天时,WT小鼠来源EPCs的Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双阳性率达到80.23±3.98％,而Aldh2-/-小鼠EPCs的双阳性率只有52.66±10.54％.培养至第三周时,CD31流式检测表明,Aldh2基因缺失降低EPCs CD31的表达.结论 Aldh2基因缺失影响EPCs的增殖效率及功能.这一作用可能会影响其在临床缺血性疾病中的推广应用.
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冠心病患者心局部血管内皮生长因子的检测及临床意义
目的检测冠心病患者冠状静脉与主动脉血清中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度差值,并探讨VEGF在冠心病发生、发展过程中的临床意义.方法冠心病组36例患者经选择性冠状动脉(冠脉)造影均被证实有明显的冠脉狭窄,对照组10例经临床检查和选择性冠脉造影排除冠心病.通过酶联免疫吸附法测定冠状静脉和主动脉血清中VEGF浓度,计算两个部位之间的差值,比较冠心病组[包括稳定型心绞痛(SAP)、急性冠脉综合征(ACS)]和对照组冠状静脉-主动脉VEGF浓度差值间的差异.采集对照组循环外周血进行内皮祖细胞(EPCs)的分离培养,7 d后搜集贴壁的梭形细胞,采用改良的Boyden小室检测VEGF对于EPCs迁移功能的影响.结果 SAP组和ACS组患者冠状静脉-主动脉VEGF浓度差值较对照组明显升高,SAP组与ACS组冠状静脉-主动脉VEGF差异无统计学意义.VEGF明显改善EPCs的迁移功能.结论冠心病患者心局部血清VEGF水平升高,可能参与定向趋化EPCs至血管损伤及心肌缺血部位,继而在治疗性血管新生及内膜修复过程中发挥作用.
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内皮型一氧化氮合酶基因转染促进内皮祖细胞移植对大鼠颈动脉新生内膜增生的抑制作用
目的：探讨内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因修饰的内皮祖细胞（EPCs）移植对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响。方法将携带eNOS基因的逆转录病毒载体pMCV-eNOS或携带绿荧光蛋白（GFP）的空病毒载体pMCV-GFP分别转染体外培养的EPCs，得到pMCV-eNOS-EPCs和pMCV-GFP-EPCs。分别将转染的pMCV-eNOS-EPCs、pMCV-GFP-EPCs或生理盐水从尾静脉移植至颈动脉内皮损伤大鼠模型。术后14 d采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、蛋白质印迹法、免疫组织化学及苏木素-伊红（HE）染色方法进行检测。结果 eNOS-EPCs组eNOS信使RNA（mRNA）及蛋白表达水平较GFP-EPCs组及对照组显著增高。与对照组比较，球囊损伤后14 d EPCs移植可显著抑制新生内膜的过度增殖，血管腔狭窄程度显著减轻[eNOS-EPCs组（0.58±0.05）比对照组（1.56±0.21），P＜0.01；GFP-EPCs组（0.84±0.09）比对照组，P＜0.01]。eNOS过表达可进一步增强EPCs的抗增殖效应[eNOS-EPCs组（0.58±0.05）比GFP-EPCs组（0.84±0.09），P＜0.05]，显著改善内皮依赖性血管舒张反应。结论 eNOS基因修饰可有效促进EPCs对损伤血管内膜的抗增殖作用，显著改善血管内皮功能。
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2型糖尿病外周血内皮祖细胞增殖、分化及细胞周期变化
目的 观察2型糖尿病(T2DM)患者外周血内皮祖细胞(EPC)增殖、分化能力及细胞周期分布.方法 T2DM患者(DM组)和非T2DM患者(Con组)各20例,离心法获取外周血单个核细胞,培养7天后,鉴定EPC,检测EPC增殖能力、EPC分化及细胞周期分布.结果 DM组外周血EPC数量及增殖能力明显降低; EPC数量、增殖能力与HbA1c水平和DM病程呈负相关;EPC表达CD14+、CD64+明显高于Con组,而表达vWF+明显低于Con组;EPC在S期的比例明显减少,在G0/G1期的比例增高.结论 T2DM患者外周血EPC数量减少、增殖能力受损、向内皮细胞系分化减少.
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2型糖尿病外周血内皮祖细胞的诱导分化及影响因素的研究
目的观察2型糖尿病(T2DM)外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC)在体外的分化增殖能力及影响因素.方法取20例T2DM无并发症患者、19例T2DM合并血管并发症患者和21例对照人群外周血EPC培养,观察细胞形态学变化并计数,用流式细胞仪检测贴壁细胞的特异性标志.结果糖尿病血管并发症组培养获得的EPC和EPC集落低于糖尿病无并发症组(P＜0.05)和对照组(P＜0.01).EPC数量与SBP及FPG呈负相关(R=-0.266,P＜0.05;R=-0.619,P＜0.01),糖尿病人EPC集落生成数量与HbA1c水平呈负相关(R=-0.749,P＜0.05),与糖尿病病程年呈负相关(R=-0.406,P＜0.01). 结论FPG和SBP与EPC的增殖分化有关,T2DM外周血EPC数目减少,与HbA1c、SBP及病程相关.
