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人牙髓干细胞的体外培养及神经样诱导分化
背景：牙髓组织来源干细胞的发现及概念的确立有助于从细胞水平上认识牙齿发育和再生修复机制。目的：了解人牙髓干细胞向神经元样细胞诱导分化能力和诱导分化条件。方法：取健康青年人的第三磨牙的牙髓组织后，制成单细胞悬液，加入含有体积分数为15%胎牛血清α-MEM培养基在6孔板培养，传代培养后加入丁羟基茴香醚、forskolin、β-巯基乙醇、碱性成纤维细胞生长因子诱导剂进行培养。结果与结论：免疫荧光和反转录-聚合酶链反应检测显示，诱导2周后人牙髓细胞除了stro-1，Col-Ⅰ，牙本质涎蛋白表达阳性外，还有巢蛋白，神经元特异性烯醇化酶的表达也是阳性，而牙龈纤维细胞表达均为阴性。说明人牙髓组织中存在成体干细胞，在一定的诱导培养条件下，牙髓干细胞有向神经元样细胞分化的潜能。
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地塞米松诱导牙周膜干细胞的定向成骨分化及凋亡
背景：牙周膜干细胞是一类起源于牙组织的成体干细胞，具有良好的成骨分化能力，有望在骨组织工程中得到应用。
目的：观察成骨诱导液对牙周膜干细胞成骨分化能力及细胞早期凋亡的影响。
方法：从原代牙周膜组织中分离得到牙周膜干细胞，以1×104/cm2浓度铺板后开始诱导。利用1，10，100 nmol/L地塞米松、β-磷酸甘油钠、维生素C为成骨诱导剂，以碱性磷酸酶活性检测、茜素红矿化结节染色、荧光定量PCR等方法对细胞成骨情况进行鉴定，采用AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡情况。
结果与结论：地塞米松可有效诱导牙周膜干细胞成骨分化，可显著提高碱性磷酸酶活性，促进茜素红矿化结节形成，提高成骨相关基因骨粘连蛋白及Ⅰ型胶原表达。根据碱性磷酸酶活性和矿化结节实验结果，地塞米松的成骨诱导具有浓度梯度效应，其中100 nmol/L 地塞米松具有佳成骨诱导能力。细胞凋亡结果提示，地塞米松诱导的成骨分化具有一定促凋亡作用，可诱导牙周膜细胞的早期凋亡。 -
富血小板血浆与间充质干细胞增殖和胶原的产生
背景：间充质干细胞是可大量获取的肌腱组织工程种子细胞，但如何体外诱导成为此项技术的关键。
目的：观察富血小板血浆对体外培养间充质干细胞分裂增殖和胶原产生的影响。
方法：分离培养兔间充质干细胞，设立富血小板血浆高、中、低剂量组干预间充质干细胞，并设空白组做对照。
结果与结论：富血小板血浆高、中、低组间充质干细胞均保持较高的增殖活性，呈快速生长，曲线上升幅度大，与空白对照组比较差异有显著性意义(P <0.05)。培养时间越长作用越明显，培养一定时间后其作用具有剂量依赖性，较高剂量的富血小板血浆对细胞的增殖作用较为明显。提示富血小板血浆能明显促进间充质干细胞的Ⅰ和Ⅲ型胶原合成，剂量越大，刺激胶原产生的作用越明显。 -
大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外分离及培养鉴定
背景：目前椎间盘髓核组织的细胞组成和特性仍未阐明。
目的：旨在建立大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外培养体系，并对其体外多项分化潜能进行鉴定。
方法：体外培养SD大鼠盘髓核来源间充质干细胞，取第3代细胞进行三系诱导分化，将成骨、成脂和成软骨分化作为实验组，基础细胞培养作为对照组。
结果与结论：低密度培养获得的髓核来源细胞早期可形成葵花样细胞集落，克隆样生长。第3代后，细胞形态趋向均一，呈成纤维细胞样生长。成骨诱导28 d，实验组茜素红染色阳性，且 RunX2、osteopontin 及osteocalcin表达较对照组显著增高(P<0.05)；成脂诱导21 d，实验组油红O染色阳性，C/EBPα及PPARγ2表达较对照组显著增高(P <0.05)；成软骨分化诱导21 d，实验组番红O快绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性，aggrecan和Col2a1表达较对照组显著增高(P<0.05)。可见成年SD大鼠椎间盘髓核组织中可分离培养出体外呈克隆样生长的细胞群，且有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能。 -
慢病毒介导稳定过表达β-catenin可促进间充质干细胞的增殖和迁移
背景：β-catenin 是 wnt/β-catenin 信号通路中关键的信号分子，参与调控细胞增殖、分化以及组织自我修复的平衡。
目的：建立慢病毒介导的过表达β-catenin基因的大鼠间充质干细胞株，观察β-catenin基因对间充质干细胞增殖和迁移的影响。
方法：构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体pLV-catenin-RFP，采用人胚肾上皮细胞293T进行包装，收集、浓缩病毒，感染间充质干细胞株，经过嘌呤霉素加压筛选，建立稳定过表达β-catenin基因的间充质干细胞。通过实时荧光定量 PCR、细胞生长曲线、MTT 实验、Transwel 体外细胞迁移实验研究稳定过表达β-catenin基因对间充质干细胞增殖和迁移的影响。
结果与结论：成功包装靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体pLV-catenin-RFP，建立稳定过表达β-catenin基因的间充质干细胞。与空载对照pLV-RFP组和正常间充质干细胞组相比，实时荧光定量PCR证实，慢病毒pLV-catenin-RFP组mRNA表达明显增高(P<0.05)；MTT和生长曲线显示pLV-catenin-RFP组使细胞倍增时间缩短(P<0.05)，增殖能力增加；细胞迁移实验显示pLV-catenin-RFP组使细胞迁移能力增加(P<0.01)。结果可见慢病毒介导稳定过表达β-catenin基因能使间充质干细胞的增殖能力及迁移能力增强。 -
人类皮肤来源前体细胞的表型和特征
背景：研究证实，从人类的皮肤中成功分离出皮肤源性前体细胞并在体外长期培养，可分化为神经元、胶质细胞、平滑肌细胞以及具有周围神经元表型的细胞和许旺细胞。
目的：进一步证实人皮肤组织来源的多能干细胞的培养方法和多方向分化能力，尤其向神经细胞、成骨细胞分化的可能性。
方法：采用胰蛋白酶消化法培养人皮肤组织来源的前体细胞，应用免疫细胞化学的方法对细胞进行鉴定。取三四代的细胞分别进行神经元诱导分化、成骨细胞诱导分化、von Kossa 法钙染色、软骨细胞诱导分化、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色及苏丹黑染色。观察皮肤来源的前体细胞巢蛋白、波形蛋白、βⅢ管蛋白、S100及Ⅱ型胶原的表达。
结果与结论：用胰蛋白酶消化法培养出人皮肤组织来源的前体细胞，增殖聚集能够形成悬浮的细胞球，在培养的不同时间都可检测到巢蛋白阳性的细胞。培养的全部细胞表达波形蛋白，在贴壁的细胞中也能检测到βⅢ管蛋白的表达。利用丹参诱导皮肤源性前体细胞向神经元样细胞分化，表达神经细胞的标志物。应用成骨细胞诱导，von Kossa 染色发现培养皿中有黑色的钙化结节产生，说明皮肤源性前体细胞能够分化为成骨细胞；将皮肤源性前体细胞向软骨细胞诱导，甲苯胺蓝染色强阳性，部分细胞表达Ⅱ型胶原，证明分化的细胞中含有软骨细胞。实验结果证实，皮肤中存在的多能干细胞能够分化为成骨细胞、软骨细胞、许旺细胞和少突胶质细胞。 -
异丙肾上腺素影响下颌下腺干/祖细胞增殖的数量还是能力？
背景：异丙肾上腺素注射能够促进啮齿类动物涎腺腺泡细胞增殖、肥大。然而，异丙肾上腺素注射后涎腺干/祖细胞的增殖能力目前仍不清楚。
目的：研究异丙肾上腺素腹腔注射对SD大鼠下颌下腺干/祖细胞激活、增殖能力。
方法：SD大鼠随机分为2组，分别腹腔注射异丙肾上腺素与生理盐水，连续注射5 d后取下颌下腺，酶消化法制取下颌下腺细胞悬液，体外培养，获得下颌下腺类上皮细胞集落并计数。挑取增殖较快的集落，进行CD90.1、层粘连蛋白、α6β1等免疫细胞化学检测。
结果与结论：与对照组相比，异丙肾上腺素注射组中、低增殖集落数量较少，高增殖集落数量较多，差异有显著性意义(P<0.05)，而集落总数无明显区别(P>0.05)。高增殖下颌下腺类上皮细胞集落CD90.1、层粘连蛋白、α6β1抗体均为阳性表达。实验结果显示，异丙肾上腺素注射不能明显增加下颌下腺中的干/祖细胞数量，但是能提高腺体中干/祖细胞的增殖能力。 -
晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化
背景：间充质干细胞是组织工程中常用的种子细胞，而来源于人膝关节滑膜组织的间充质干细胞能否作为骨组织修复与再生中合适的种子细胞还需要进一步验证。
目的：观察晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源的间充质干细胞体外向成骨细胞定向分化的潜能，对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。
方法：无菌条件下从行全膝关节置换的晚期骨关节炎患者膝关节腔内获取滑膜组织，Ⅰ型胶原酶消化分离获得有核细胞。以适密度接种(200个有核细胞/cm2)，挑选单细胞克隆，筛选出滑膜间充质干细胞。基础培养基培养，传至第3代时改换为含地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸的成骨诱导培养基诱导培养。
结果与结论：体外分离培养的滑膜间充质干细胞早期可形成葵花样细胞集落，克隆样生长。传代至第3代，细胞呈成纤维细胞样生长，形态均一。滑膜间充质干细胞成骨诱导后呈典型的“铺路石样”成骨细胞形态，诱导至第7天碱性磷酸酶染色呈强阳性，碱性磷酸酶活性表达也在诱导7 d时达高峰；诱导21 d茜素红染色可见大量钙结节形成；同时反转录PCR检测到Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达在诱导后增加，21 d时表达高。从晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织分离获得的滑膜间充质干细胞，在体外可成功诱导分化为成骨细胞，所诱导生成的细胞具有典型的成骨细胞特性。提示滑膜间充质干细胞有望成为骨组织工程理想的种子细胞来源，在骨组织的再生修复中发挥重要作用。
