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人牙周韧带细胞成骨诱导分化后的超微结构观察
目的 观察成骨诱导分化培养前后,人牙周韧带细胞超微结构的变化.方法 对人牙周韧带细胞进行体外培养,并进行成骨诱导分化,14d后行透射电子显微镜观察.结果 体外成骨诱导分化培养后,人牙周韧带细胞内细胞器发达,数目较常规培养条件下明显增多.细胞内可见大量的基质小泡、髓样结构及中、低电子密度的圆形和椭圆形小泡样结构.结论 人牙周韧带细胞是一种具有成骨潜能的细胞,经成骨诱导分化培养后,其超微结构具有成骨细胞和成牙骨质细胞的特点.
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子痫前期患者胎盘间充质干细胞抑制淋巴细胞增殖的研究
目的：纯化和体外培养子痫前期患者的胎盘间充质干细胞（ pMSCs），研究子痫前期患者pMSCs的免疫抑制能力。方法从子痫前期患者及正常妊娠者胎盘组织中纯化培养pMSCs，应用Transwell板将pMSCs与混合淋巴细胞共培养，检测淋巴细胞数，计算淋巴细胞增殖抑制率。在培养基中加入干扰素γ，分别从mRNA水平和蛋白质水平检测pMSCs的吲哚胺双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）表达水平。结果来源于子痫前期患者的PMSCs和正常妊娠者的形态相同，表达CD44、CD29、CD73、CD90、CD105、HLA-I类分子，极少表达CD34、CD45、CD14及HLA-Ⅱ分子。能够在体外被诱导分化为成骨细胞及成脂细胞。细胞释放的可溶性分子具有抑制淋巴细胞增殖的作用；细胞表达低水平的IDO，但当受到IFN-γ刺激后，表达水平显著提高（ P ＜0．05）。对照正常妊娠组和子痫前期组pMSCs对淋巴细胞增殖的抑制率和表达IDO水平，差异均不具有显著性（ P ＞0．05）。结论 pMSCs所表达的IDO和释放的可溶性分子可能与PE的发生、发展无关；由于现有体外培养技术不能反映pMSCs在体内的状态，也可能导致原本存在的差异难以体现出来。
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晚期骨关节炎患者膝关节滑膜间充质干细胞的体外成骨分化
背景：间充质干细胞是组织工程中常用的种子细胞，而来源于人膝关节滑膜组织的间充质干细胞能否作为骨组织修复与再生中合适的种子细胞还需要进一步验证。
目的：观察晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织来源的间充质干细胞体外向成骨细胞定向分化的潜能，对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。
方法：无菌条件下从行全膝关节置换的晚期骨关节炎患者膝关节腔内获取滑膜组织，Ⅰ型胶原酶消化分离获得有核细胞。以适密度接种(200个有核细胞/cm2)，挑选单细胞克隆，筛选出滑膜间充质干细胞。基础培养基培养，传至第3代时改换为含地塞米松、β-甘油磷酸钠和抗坏血酸的成骨诱导培养基诱导培养。
结果与结论：体外分离培养的滑膜间充质干细胞早期可形成葵花样细胞集落，克隆样生长。传代至第3代，细胞呈成纤维细胞样生长，形态均一。滑膜间充质干细胞成骨诱导后呈典型的“铺路石样”成骨细胞形态，诱导至第7天碱性磷酸酶染色呈强阳性，碱性磷酸酶活性表达也在诱导7 d时达高峰；诱导21 d茜素红染色可见大量钙结节形成；同时反转录PCR检测到Ⅰ型胶原、Runx2、骨结合蛋白和骨桥蛋白的表达在诱导后增加，21 d时表达高。从晚期骨关节炎患者膝关节滑膜组织分离获得的滑膜间充质干细胞，在体外可成功诱导分化为成骨细胞，所诱导生成的细胞具有典型的成骨细胞特性。提示滑膜间充质干细胞有望成为骨组织工程理想的种子细胞来源，在骨组织的再生修复中发挥重要作用。 -
芳香化酶和雌激素相关受体在人骨髓间充质干细胞中的表达
背景：骨髓间充质干细胞中可能存在芳香化酶和雌激素受体相互作用的雌激素信号途径，调控骨髓间充质干细胞生物活性。
目的：观察成人骨髓间充质干细胞成骨诱导分化过程中芳香化酶和雌激素相关受体的表达。
方法：将骨髓间充质干细胞分为单纯培养组和成骨诱导组，分别用低糖DMEM完全培养基和成骨诱导分化完全培养基培养，MTT检测细胞增殖能力，茜素红染色观察成骨矿化能力，qPCR和Western blot检测芳香化酶、雌激素受体α、雌激素受体β和雌激素受体相关受体αmRNA和蛋白表达，ELISA检测细胞上清液和裂解液中雌二醇水平。
结果与结论：培养72 h，成骨诱导组增殖能力强；培养21 d，成骨诱导组茜素红染色显示大量钙沉积；qPCR和Western blot结果显示成骨诱导组能促进芳香化酶和雌激素受体αmRNA和蛋白表达，抑制雌激素受体相关受体αmRNA和蛋白表达，成骨诱导组雌激素受体βmRNA和蛋白表达与单纯培养组无差异；ELISA结果显示成骨诱导组上清液中雌二醇水平高于裂解液及单纯培养组上清液中雌二醇水平。结果表明成人骨髓间充质干细胞及成骨诱导分化后能表达芳香化酶、雌激素受体α、雌激素受体β和雌激素受体相关受体α，亦能自身合成和分泌雌激素，由此产生的雌激素可能是通过相关受体对骨髓间充质干细胞成骨分化发挥作用。 -
SDF-1α复合Pluronic F-127对兔上颌窦底提升术成骨影响的实验研究
目的:通过制备基质细胞衍生因子(SDF1-α)的Pluronic F-127复合凝胶材料,观察这种复合材料在体外对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的矿化及成血管作用和复合凝胶材料在兔上颌窦外提升术中的成骨及成血管效果.方法:将兔骨髓间充质干细胞、50ng/ml SDF1-α和质量百分比浓度0.1%的Pluronic F-127复合培养,MTT法检测其细胞毒性,碱性磷酸酶活性测定及茜素红染色.将18只新西兰大白兔双侧进行上颌窦外提升术,双侧植入不同的复合材料(共3种)并进行对照.材料分别为:β-磷酸三钙(β-TCP),生理盐水及SDF-1α复合Pluronic F-127凝胶.于术后4、8、12周处死,X线片观察双侧上颌窦骨质形成情况,行HE染色、CD31+、CD34+、BMP-2及VEGF免疫组织化学染色观察成骨及成血管作用,并进行统计学分析.结果:体外实验采用MTT法证实了0.1%w/w Pluronic F-127无细胞毒性(P>0.05).BMSCs-SDF1α复合凝胶碱性磷酸酶染色下,细胞质可见大量碱性磷酸酶染色沉淀,其余3组未见沉淀.BMSCs-SDF1α复合凝胶、BMSCs-单纯凝胶、单纯BMSCs在成骨诱导培养条件下均产生矿化结节,非成骨诱导组未见矿化结节形成.体内实验,X线片结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶及β-TCP充填侧均有阻射影,生理盐水组未见明显阻射影;HE染色结果显示BMSCs-SDF1-α复合凝胶成骨效果与β-TCP成骨效果明显,生理盐水组未见骨质形成,统计学分析表明BMSCs-SDF1-α 复合凝胶成血管作用较β-TCP及生理盐水组明显增加.结论:SDF-1α 复合Pluronic F-127凝胶能够成功诱导BMSCs分化为成骨细胞,无细胞毒性,在体外及兔上颌窦内成骨、成血管效果明显.
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SDF-1α复合Pluronic F-127的构建及其对BMSCs的体外生物效应研究
目的 构建装载基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的Pluronic F-127新型复合材料,并研究其对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外生物效应.方法 构建装载不同浓度SDF-1α(200、50 ng/ml)的Pluronic F-127复合水凝胶,采用Transwell小室进行复合水凝胶对BMSCs的体外趋化实验.将BMSCs与复合材料均匀混合,加成骨细胞诱导液进行培养,并对其行碱性磷酸酶(AKP)活性测定及茜素红染色,由结果可观察到BMSCs的成骨诱导分化情况,并用MTT法检测复合培养后细胞的活性状况.结果 趋化实验结果显示,含SDF-1α浓度为200 ng/ml的复合水凝胶对BMSCs的募集效果显著(P＜0.05).MTT法证实了Pluronic F-127对细胞增殖不产生影响(P＞0.05).BMSCs-复合材料、单纯BMSCs在成骨诱导培养条件下,两组细胞的AKP表达量均明显增高,并且都高于非成骨诱导组(P＜0.05),同时诱导组镜下可见明显的钙结节形成.结论 成功构建装载SDF-1α的Pluronic F-127新型复合材料,其在体外对BMSCs有明显的趋化作用,在细胞材料复合培养的三维支架中,BMSCs能够存活并被成功诱导分化为成骨细胞.
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人脐带间充质干细胞分离和初步鉴定
目的 寻找一种高效获得稳定人脐带间充质干细胞的方法.方法 采集3例足月剖宫产健康胎儿脐带,剥离血管及外膜得到Wharton's胶.贴壁培养脐带Wharton's胶,收集爬出的细胞进行传代,观察细胞形态;取第3代细胞采用流式细胞学检测细胞表面抗原的表达情况;使用成骨、成脂诱导分化的方法对第3代细胞进行分化潜能的鉴定,成骨诱导细胞用茜素红染液染色,成脂诱导细胞用油红O染液染色,并与未诱导分化的细胞进行比较.结果 Wharton's胶培养10 d左右可见梭形细胞从脐带组织逸出,贴壁培养细胞,可见呈放射状或螺旋状生长;流式细胞仪检测结果显示细胞表面抗原CD29、CD44呈高表达,CD34、CD45呈低表达;成脂诱导培养基中细胞油红O染色可见红色脂滴,成骨诱导培养基中细胞茜素红染色可见红色钙质结节,未诱导的细胞未见脂滴及结节样改变.结论 贴壁培养的细胞符合间充质干细胞生长的形态,有向成骨、成脂分化的能力;贴壁法培养脐带Wharton胶可得到稳定的间充质干细胞.
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大鼠BMSCs成骨诱导及复合支架材料构建组织工程骨组织的研究
目的 利用诱导成骨分化的骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)复合生物支架材料构建组织工程骨组织.方法 采用密度梯度离心法获取大鼠骨髓间充质干细胞,原代培养扩增后,条件培养基诱导成骨分化作为实验组,并设非条件培养基培养为对照组.诱导培养后,通过碱性磷酸酶、钙结节染色;Ⅰ型胶原、骨钙素检测鉴定成骨性.将诱导的BMSCs利用滴加法种入自制组织工程生物支架复合培养,采取扫描电镜、HE切片染色观察培养8天时细胞在支架内部的生长情况.结果 密度梯度离心法获取培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或三角形贴壁生长,以梭形为主;经成骨诱导剂诱导后细胞呈多角形贴壁生长,碱性磷酸酶染色呈阳性、茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显增加(P＜0.05);ELISA法检测骨钙素结果较对照组明显升高(P＜0.01).HE切片染色可见支架内部有细胞长入,细胞呈圆形或椭圆形.扫描电镜可见支架内部有大量细胞长入,细胞粘附、生长良好,呈现完全伸展状态,细胞-支架-细胞之间有基质连接.结论 本实验获取的原代细胞为骨髓间充质干细胞,诱导剂诱导后成功分化为成骨细胞.采用经诱导成骨后的细胞作为组织工程骨构建的种子细胞,与三维支架材料复合后共培养,使构建的组织复合物更接近骨组织,为临床大段骨缺损的修复增加可能性.
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诱导hBMSCs成骨分化中微小RNA和靶基因表达水平的变化
目的 明确萎缩性骨不连组织中表达上调的数种微小RNA (micro RNA,miRNA)与其相应靶基因mRNA、蛋白在hBMSCs成骨分化过程中的表达变化趋势和生物学功能. 方法 取自体髂骨植骨手术患者的髂骨骨髓血,采用密度梯度离心法分离培养hBMSCs.取第4代hBMSCs以成骨诱导培养液诱导成骨分化,分别提取0、12h,1、2、4、7、14d时的细胞总RNA和蛋白,进行miRNA的实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、相应靶基因mRNA的qRT-PCR和蛋白Western blot检测. 结果 诱导hBMSCs成骨分化时,成骨性靶基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase liver/bone/kidney,ALPL)、PDGF-α多肽(PDGF-α polypeptide,PDGF-A)和BMP-2的mRNA和蛋白表达在多数时间点同对照(0 h)相比增加(BMP-2在12h和1d时下降),1～7 d变化为显著.不同时间点的miRNA、靶基因mRNA和蛋白表达水平存在差异,其中hsa-miRNA-149*和hsa-miRNA-654-5pmiRNA含量的变化趋势与各自靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白表达水平总体上成负相关(P＜0.05),hsa-miRNA-221与其靶基因PDGF-A的变化趋势无明显负相关关系(P＞0.05). 结论 诱导hBMSCs成骨分化过程中,hsa-miRNA- 149*和hsa-miRNA-654-5p对其相应靶基因ALPL和BMP-2的mRNA及蛋白存在密切调控关系.
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辛伐他汀对大鼠BMSCs成骨诱导Wnt信号传导通路相关因子mRNA表达的影响
目的 探讨辛伐他汀(simvastatin,SIM)对大鼠BMSCs成骨分化过程中Wnt信号传导通路相关因子mRNA表达的影响,研究SIM促进BMSCs成骨分化的作用机制.方法 取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨骨髓细胞,全骨髓培养法进行原代和传代培养.取第2代细胞换用成骨诱导培养基培养,并将细胞分为2组,实验组加入1×10-7mol/L SIM,对照组加入等量无水乙醇和PBS.诱导培养7 d倒置相差显微镜观察两组细胞形态,并行ALP染色观察;培养28 d行von Kossa染色观察ECM矿化;培养7、14 d采用实时定量PCR检测Wnt信号传导通路相关因子Axin2、β-catenin、骨钙素(osteocalcin,OC)、frizzled-2、Lef-1、Wnt5a mRNA的表达.结果 诱导培养7 d倒置相差显微镜观察显示,实验组以多边形和三角形细胞居多;对照组细胞多呈长梭形,少数为小圆形或三角形.诱导培养7 d ALP染色观察显示,实验组细胞质中出现蓝染的ALP,阳性染色细胞和区域明显多于对照组;培养28 d von Kossa染色观察显示,两组细胞均可见点状及片状钙沉积,与对照组相比,实验组钙沉积明显增多.实时定量PCR检测显示,诱导培养7 d,实验组Axin2 mRNA表达水平显著低于对照组,frizzled-2、Lef-1 mRNA表达水平显著高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05):其余各因子mRNA表达两组差异无统计学意义(P>0.05);培养14 d,实验组除β-catenin外,其余各因子mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05).结论 SIM可促进BMSCs向成骨细胞分化,并伴Wnt信号途径相关因子mRNA表达水平的改变.
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大鼠脂肪干细胞体外培养及成骨诱导分化研究
目的:观察SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的基本生物学特性、鉴定其诱导成骨分化潜能.方法:无菌条件下取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,0.1％Ⅰ型胶原酶消化,分离培养.显微镜下观察细胞形态；采用MTT比色法绘制细胞生长曲线；用流式细胞仪检测细胞表面标志物；取第3代细胞行成骨和成脂诱导培养,分别用碱性磷酸酶(ALP)、茜素红染色和油红O染色鉴定成骨诱导效果.结果:从SD大鼠脂肪组织中分离获得的ASCs呈长梭形或多角形,呈集落生长；细胞生长曲线呈“S”型,具有较强的增殖能力；流式细胞仪分析示:CD29、CD90高表达,CD34、CD45低表达；成骨诱导后ALP染色及茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性.结论:分离培养的细胞为ASCs,具有成骨潜能.
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2型糖尿病大鼠脂肪干细胞体外成骨能力的研究
目的：比较2型糖尿病（T2MD）大鼠和正常SD大鼠脂肪来源干细胞（ASCs）的增殖及多向分化能力。方法：取16只SPF级8周龄SD大鼠，随机分为两组（n＝8）：糖尿病组，采用高脂高糖饲料构建T2DM大鼠模型；对照组常规饲料喂养，比较两组大鼠的血糖水平。建模成功8周后，分别培养两组大鼠腹股沟处的ASCs，显微镜下观察细胞形态；CCk－8法检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞表面标志物；取第3代细胞行成骨和成脂诱导实验，实时定量PCR检测成骨诱导7 d时成骨相关基因的表达。结果：两组大鼠脂肪组织均可分离获得ASCs，且细胞形态和增殖能力无显著差异（P＞0．05）；两组细胞均高表达CD44和CD90，低表达CD34和CD45；T2DM大鼠P3代ASCs成脂诱导后油红O染色较正常组强，而成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红染色较正常组弱；ALP蛋白活性检测较正常组低；ALP、OCN、OPG和RUNX2等成骨相关基因的表达水平较正常组低。结论：T2DM大鼠ASCs体外成骨分化能力较弱。
