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TNT对小鼠活体精原细胞SCE频率的影响
近年来国内外学者对TNT致突变性进行了较为广泛的研究.本实验采用姊妹染色单体交换(SCE)检测方法,观察了TNT对小鼠活体精原细胞SCE频率的影响,从而为TNT致畸和致癌等远期效应的深入研究提供了一定的实验依据.1 材料与方法1.1 动物第四军医大学实验动物研究中心提供,20～25 g健康雄性昆明小鼠.1.2 试剂 TNT由某兵工厂提供,研成粉末与少量精制植物油混匀,配制不同剂量的植物油溶液或过饱和溶液,供小鼠灌胃染毒用;5-溴脱氧尿苷(BrdU),Sigma公司产品;767针剂型活性炭,上海活性炭厂产品;质量浓度为0.04%的秋水仙素;20 mg/ml环磷酰胺(CP)储备液;0.3 mol/L氯化钠(NaCl)溶液与0.03 mol/L柠檬酸钠(Na\-3C\-6H\-5O\-7)溶液的等量混合液(2×SSC);pH6.8的磷酸缓冲液及质量浓度为2.5%的Geimsa染液.
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电针对局灶性脑缺血成年大鼠内源性神经干细胞增殖的影响
目的: 研究成年大鼠脑缺血后缺血脑区神经干细胞增殖情况及电针干预对其影响,探讨电针治疗缺血性脑损伤的作用机制.方法: 采用开颅热凝闭法制作大脑中动脉闭阻(MCAO)模型,随机分为模型组与电针组,缺血后用溴脱氧尿苷(BrdU)腹腔注射标记增殖的神经细胞,选用"大椎"、"百会"行电针干预,采用BrdU免疫组化观察脑缺血后第3 d、7 d、14 d与21 d四个不同时相BrdU阳性细胞数量的变化情况.结果: 脑缺血后不同时相缺血侧皮质、齿状回、纹状体和SVZ均有BrdU阳性细胞,其中第7 d的阳性细胞数量增加为显著(P＜0.01);而且电针组在不同时相的细胞数量均较同时相模型组有明显的增加(P＜0.05或P＜0.01).结论: 缺血可激发相关脑区神经干细胞的增殖,电针可起到促进作用,推论这种作用可能是电针治疗脑缺血的重要作用机制之一.
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骨髓单个核细胞移植在脑梗死小鼠脑内分化为星形胶质样细胞的研究
目的 探讨骨髓单个核细胞(BMMNC)移植对大脑中动脉栓塞小鼠的治疗作用以及脑内分化情况.方法 选择41只雄性昆明小鼠,采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型后,将制模成功的34只小鼠随机分为溶剂组和BMMNC移植组(移植组),每组17只.分别于模型成功后1、3、7、14和28 d采用改良神经功能缺损评分(mNSS)评价小鼠神经损害严重程度,免疫荧光双标法观测BMMNC脑内分化情况.结果 与溶剂组比较,移植组1、3、7、14和28 d各时间点mNSS明显降低[(12.54±1.50)分vs (13.02±1.52)分、(9.52±1.25)分vs (11.17±1.05)分、(7.92±1.24)分vs (10.75±1.06)分、(5.82±1.23)分vs (7.93±1.23)分、(4.92±1.25)分vs (6.83±1.12)分,P＜0.05];移植组梗死皮质及海马齿状回区5-溴脱氧尿嘧啶核苷和胶质纤维酸性蛋白双标阳性细胞.结论 BMMNC移植在脑梗死小鼠脑内分化为星形胶质样细胞,能显著改善脑梗死小鼠神经功能.
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成年大鼠脑缺血再灌注损伤后海马齿状回神经发生的实验研究
目的观察成年大鼠全脑缺血再灌注损伤对海马齿状回神经的影响,并探讨缺血性脑损伤后神经发生的相关机制.方法采用4支血管闭塞法建立大鼠全脑缺血模型,应用5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine,BrdU)标记分裂细胞、观察全脑缺血-再灌注损伤后3、7、14、21 d时大鼠海马齿状回神经前体细胞的增殖速度.并应用免疫荧光双标记法结合激光共聚焦显微镜观察确定新生细胞的分化特点.结果全脑缺血-再灌注损伤后齿状回神经前体细胞增殖速度在7～14 d时明显增加,BrdU免疫阳性细胞数目与相应对照组比较,差异有显著性意义(P＜0.01).21 d时恢复正常水平.新生细胞大多迁移入颗粒细胞层,并分化为神经元.结论缺血性脑损伤可增强海马齿状回神经发生,其机制可能与缺血引起的激素水平、神经递质、神经营养因子浓度改变以及齿状回局部微环境变化有关.
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霉酚酸对外周血T淋巴细胞活化抗原表达和增殖的影响
目的探讨免疫抑制剂霉酚酸酯的活性代谢产物霉酚酸(MPA)对外周血T淋巴细胞活化、增殖的影响.方法分离外周血单个核细胞,以植物血凝素(PHA)作为刺激剂,加或不加免疫抑制剂MPA和环孢素A(CSA),分组体外培养.以流式细胞仪检测:T淋巴细胞表面标志CD3;T细胞活化抗原CD69/CD3、CD25/CD3、溴尿嘧啶脱氧核糖核苷 (BrdU)掺入率及细胞周期.结果 (1)MPA、CSA均能显著抑制T淋巴细胞表面标志抗原CD3的表达,96 h时,MPA浓度1组、CSA浓度1组分别为(37.60±7.89)%、(55.85±13.64)%,与对照组(74.20±7.51)%比较,差异有显著性(P值分别为0.000、0.004);(2)对预先活化72 h的T淋巴细胞,MPA能显著抑制CD3的表达,继续培养96 h时,MPA组、CSA组分别为(52.90±7.35)%、(65.05±10.82)%,与对照组(78.80±5.09)%比较,差异有显著性(P值分别为0.049、0.188);(3)MPA、CSA均不影响24 h时T淋巴细胞CD69的表达,MPA组、CSA组分别为(55.03±13.98)%、(38.30±17.38)%,与对照组(50.11±19.28)%比较,差异无显著性(P＞0.005);(4)MPA、CSA均能抑制T细胞表面CD25的表达,72 h时,MPA浓度1组、CSA浓度1组分别为(37.15±7.15)%、(62.47±12.50)%,与对照组(84.85±8.46)%比较,差异有显著性(P值分别为0.000、0.036);(5)MPA(10-5 mol/L)使T淋巴细胞的BrdU掺入率降低,72 h时MPA组、对照组分别为(9.77±7.55)%、(43.27±18.85)%差异有显著性(P=0.046),MPA使活化T细胞的S期比例降低,MPA组、对照组分别为(3.90±1.90)%、(19.00±6.35)%差异有显著性(P=0.017).结论 MPA能抑制T淋巴细胞活化抗原CD25表达,使活化受抑,与CSA相似;MPA能逆转已经活化的T淋巴细胞,使CD3表达下调;MPA、CSA对T淋巴细胞早期活化抗原CD69的表达均没有抑制作用.MPA使活化T细胞的S期比例降低、BrdU掺入率降低,抑制T淋巴细胞的增殖.
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骨髓增生异常综合征患者姐妹染色单体分化的研究
目的验证骨髓细胞姐妹染色单体分化(SCD)检测法在骨髓增生异常综合征(MDS)诊断和预后判断中的意义.方法对临床上疑为MDS的50例患者分别进行5′溴脱氧尿嘧啶核苷-姐妹染色单体分化染色法(BrdU-SCD)检测和染色体核型分析.结果 50例中32例(64.0%)SCD延迟,对照组中13例急性髓系白血病(AML)患者全部延迟,非恶性血液病中仅2例(10.5%)延迟,而4例正常人中无一例延迟.MDS与AML、正常人、再生障碍性贫血(AA)、其他良性增生性贫血之间的SCD延迟率及平均细胞周期时间的差异具有显著性;而正常人与AA、其他良性增生性贫血之间的差异无显著性.随着MDS病情进展,细胞周期时间逐渐延长.50例中24例(48.0%)检出克隆性核型改变.按FAB分型不能确诊为MDS 7例中6例有克隆性异常.SCD正常组和延迟组的病死率分别为11.8%和50.0%(P＜0.05),白血病转化率分别为5.9%和16.7%(P＞0.05),中位生存时间分别为12和8个月(P=0.051).结论骨髓细胞SCD检测对MDS具有一定的鉴别诊断和预后判断意义.
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5溴脱氧尿苷和端粒酶逆转录酶标记肺干细胞在新生鼠高氧肺损伤中的作用
目的探讨5溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine,Brdu)和端粒酶逆转录酶(tolomerase reversetranscriptase,TERT)标记肺干细胞特点及其在肺发育和损伤修复中的作用.方法95%左右氧气7 d制备新生鼠高氧肺损伤模型;将Brdu自腹腔注入模型鼠,免疫组化法检测Brdu和TERT阳性显色细胞,并和表面蛋白C(surfactant protein C,SPC)抗体免疫双染.结果(1)Brdu阳性显色部位主要在各级支气管黏膜下和肺间隔,支气管黏膜上皮及肺泡壁有散在分布,阳性细胞数量较少,多呈立方形、核大;TERT阳性显色在外周肺组织,肺间隔和肺泡壁部位,数量明显少于Brdu,且阳性显色呈不对称性,即多集中在某一肺叶;(2)SPC阳性显色细胞在肺间隔和肺泡壁,分别和Brdu、TERT双染,可见少量阳性细胞;(3)Brdu、TERT和SPC表达积分在高氧组与正常氧组差异无统计学意义(P>0.05).Brdu表达积分无论在高氧组(1.61±0.83)还是正常氧组(1.43±0.85),均高于TERT(分别为0.83±0.84和0.62±0.55,P<0.05).结论Brdu和TERT作为肺干细胞标记,两者各有其特征;肺损伤时Brdu和TERT标记阳性细胞量可提示肺干细胞增殖分化及肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复情况.至于Brdu和TERT哪一个指标更具特异性,是否Brdu同时标记了已从干细胞增殖分化但尚保留干细胞特征的短暂扩增细胞,或TERT更能反映干细胞特征尚待深入研究.
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5溴脱氧尿苷和端粒酶逆转录酶标记肺干细胞在新生鼠高氧肺损伤中的作用
目的探讨5溴脱氧尿苷(Brdu)和端粒酶逆转录酶(TERT)标记肺干细胞特点及其增殖、分化在肺发育和高氧肺损伤修复中的作用.方法(1)3 d新生鼠分为高氧组(95%左右氧气7 d)、高氧组siRNA干预组(高氧同时TGF-β1 siRNA经腹腔注入,隔日1次,共3次)和正常对照组,处死前自腹腔注入Brdu.(2)免疫组化法检测Brdu和TERT阳性显色细胞,并分别使用碱性磷酸酶和辣根过氧化氢酶两种显色系统作Brdu/TERT和SPC抗体免疫双染.(3)分离新处死肺细胞,立即涂片,做Brdu和TERT免疫标记,计数阳性细胞百分比.结果(1)高氧组可见肺泡壁较薄、结构简单化、肺泡大小不均,有些肺泡融合、体积增加,肺泡腔有较多脱落的AECII.(2)肺组织Brdu阳性显色部位主要在各级支气管黏膜下和肺间隔,支气管黏膜上皮及肺泡壁有散在分布,阳性细胞数量较少,多呈立方形、核大;TERT阳性显色在外周肺组织肺间隔和肺泡壁部位,数量明显少于Brdu[表达积分(1.61±0.83)vs.(0.62±0.55),P＜0.05],且阳性显色呈不对称性,即多集中在肺某一区域;高氧肺组织Brdu和TERT阳性标记细胞稍高于正常对照组[(1.43±0.85)vs.(1.61±0.83);(0.62±0.55)vs.(0.83±0.84),P＞0.05].(3)SPC分别和Brdu、TERT双染,可见少量阳性细胞.(4)肺细胞SPC免疫显色部位在胞浆,呈棕褐色,阳性细胞大小不一,高氧组和正常组显色细胞数无明显区别,阳性细胞百分比分别为80.3%、78.6%.(5)肺细胞Brdu阳性显色细胞明显少于SPC阳性细胞,体积明显大于未显色细胞,核形态主要为致密圆形,个别呈杆状;高氧组阳性细胞数略多于正常组,阳性细胞百分比分别为28.5%、21.4%.(6)TERT阳性显色细胞更为少见,阳性细胞体积多较小,核呈多种形态包括致密圆形、疏松圆形、杆状、分叶状;正常组和高氧组阳性细胞百分比分别为1.5%、2.3%.结论(1)Brdu和TERT可作为不同分化能力的肺干细胞标记,其中TERT更能反映肺干细胞特征或是或体肺干细胞标记更特异性的指标,Brdu标记从干细胞增殖分化尚保留干细胞特征的TAC.(2)高氧肺损伤时肺干细胞出现有限增殖分化.
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喉鳞状细胞癌干细胞的BrdU标记鉴定
目的 利用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记滞留细胞的方法,研究小鼠喉黏膜和喉鳞状细胞癌（简称喉鳞癌）实体瘤内可能存在的干细胞及其分布特点.方法 出生3d的昆明小鼠,随机分为实验组和对照组.实验组小鼠皮下注射BrdU,对照组皮下注射生理盐水.第2、4、8周分别处死6只小鼠,并取喉黏膜进行免疫组化检测,计算标记滞留细胞的阳性率.被BrdU标记的喉鳞癌Hep细胞注入到6只裸鼠皮下成瘤,8周后处死并取肿瘤,HE染色及免疫组化检测.结果 实验组标记后2、4、8周,小鼠鳞状上皮和腺上皮均有标记滞留细胞表达,对照组标记后无标记滞留细胞表达.不同时间点标记滞留细胞阳性率差异具有显著性(F=140.319,P＜0.05).鳞状上皮基底层中标记滞留细胞阳性率显著高于腺体细胞(f分别为6.376、10.944、15.376,P＜0.05).结论 小鼠喉黏膜和喉鳞癌实体瘤中存在标记滞留细胞,这些标记滞留细胞被认为是喉黏膜成体干细胞及喉鳞癌肿瘤干细胞.
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流式细胞仪BrdU/DNA双参数分析法测定急性白血病细胞周期及其临床意义
研究白血病细胞的增殖动力学,探讨其与临床的关系.采用流式细胞仪(FCM) BrdU/DNA双参数分析法测定39例急性白血病骨髓细胞周期的各时相细胞比例及S期细胞的时限(Ts),其中ANLL 26例,ALL 13例;初治31例,复发8例(ANLL、ALL各4例).结果显示,急性白血病骨髓细胞S期比例显著低于正常,初治及复发白血病患者骨髓S期细胞比例之间相差不显著;复发白血病患者骨髓细胞的Ts比初治白血病患者及正常骨髓细胞的Ts都短.提示白血病细胞处于较正常低增殖状态;Ts时限短提示白血病细胞再生迅速,与急性白血病复发关系密切;Ts时限短为白血病预后不良因素之一.
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人参皂甙Rg1对大鼠局灶性脑缺血脑组织神经干细胞增殖的影响
目的 观察人参皂甙Rg1对大鼠局灶性脑缺血脑组织神经干细胞增殖的影响,探讨其在脑保护及抗衰老作用中的可能机制.方法 取成年雄性Wistar大鼠,用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,采用脉冲标记法,经腹腔注射5′-溴脱氧尿苷(BrdU)标记处于增殖状态的神经干细胞,用免疫组织化学单标及双标免疫荧光技术观察人参皂甙Rg1对局灶性脑缺血后BrdU和巢蛋白(nestin)的免疫活性及nestin/BrdU双标阳性细胞的影响,镜下观察脑内神经干细胞的分布,并计数行定量分析.结果 局灶性脑缺血后大鼠室管膜下区及海马齿状回有nestin、BrdU及nestin/BrdU双标免疫阳性细胞分布.应用人参皂甙Rg1后,上述各部位阳性细胞数明显增多,与缺血组之间有显著性差异(P＜0.01).结论 人参皂甙Rg1具有促使神经干细胞增殖的能力,这可能是其神经保护及抗衰老作用的机制之一.
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感觉神经肽SP对创面表皮干细胞迁移影响的实验研究
目的探讨感觉神经肽P物质(SP)对创面表皮干细胞迁移的影响.方法新生3～4天Wistar大鼠90只,随机分为正常组、SP组、辣椒素组,采用BrdU标记干细胞结合检测表皮干细胞特异性标记蛋白K19和β1整合素表达,观察皮肤全层缺损后21天伤口局部应用SP对伤口表皮干细胞迁移及伤口愈合的影响,并与预先注射辣椒素毁损感觉神经元(辣椒素组)和单纯皮肤损伤(正常组)比较.结果致伤后18天SP组伤口闭合,较正常组提前3天,而辣椒素组仅闭合创面面积的25.54%.伤后SP组创缘及肉芽组织出现较多表皮干细胞;而抑制感觉神经肽SP的辣椒素组仅在创缘观察到少量表皮干细胞;正常组在肉芽组织中尚未发现表皮干细胞,在创缘的表皮干细胞数介于SP组和辣椒素组之间.结论感觉神经肽SP能明显加快创面愈合速度,并具有诱导表皮干细胞向创缘和肉芽组织中迁移的作用.
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叶酸对局灶性脑梗死大鼠神经干细胞增殖作用的影响
目的:探讨叶酸对局灶性脑梗死大鼠神经干细胞增殖作用的影响.方法:成年雄性SD大鼠40只随机分为假手术组(SO)、大脑中动脉栓塞模型组(MCAO)、缺血+叶酸低剂量组(MCAO+LFA)和缺血+叶酸高剂量组(MCAO+HFA).通过叶酸灌胃给药28 d.除假手术组外,其他3组采用线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞模型.叶酸补充前、后及制造模型后7 d分别测定大鼠血清叶酸含量:采用免疫荧光双标记的方法检测各组大鼠脑缺血后脑组织BrdU+Nestin免疫荧光双标阳性细胞密度.结果:补充叶酸后.与MCAO组相比,低、高剂量叶酸组大鼠的血清叶酸水平明显升高(P<0.01),低、高剂量叶酸组大鼠脑组织BrdU+Nestin免疫荧光双标阳性神经干细胞密度高于MCAO组(P<0.01).结论:通过灌胃补充叶酸能够提高大鼠血清叶酸水平,促进脑梗死大鼠神经干细胞的增殖.从而对局灶性脑梗死大鼠具有保护作用.
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叶酸对脑梗死大鼠星形胶质细胞GFAP表达的影响
目的:探讨叶酸对脑梗死大鼠星形胶质细胞纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为假手术(SO)组、缺血(IM)组、缺血+低剂量叶酸(IM+LFA)组和缺血+高剂量叶酸(IM+HFA)组.通过叶酸灌胃给药28 d后制备大脑中动脉栓塞模型,采用免疫荧光双标记的方法检测各组大鼠脑缺血后脑组织GFAP的荧光强度及BrdU+GFAP双标阳性细胞密度.结果:在7 d及14 d 4组均可见BrdU+GFAP双标阳性星形胶质细胞,缺血+叶酸组GFAP荧光强度及BrdU+GFAP双标阳性细胞密度均高于IM组及SO组,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论:补充叶酸可以使星形胶质细胞GFAP表达增强,并促进神经干细胞的分化,从而对脑梗死大鼠具有保护作用.
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异位子宫内膜干细胞的检测及其标志物研究
目的 了解异位子宫内膜干细胞在病灶中的数量、分布及定位情况,并筛选其可能的标志物表达.方法 在子宫内膜异位症裸鼠模型建造前24 h开始进行5-溴脱氧尿苷(BrdU)脉冲标记,共5 d.在标记结束后4 h、1周、3 周、5 周、6 周、7周、8周及9周,通过免疫组化检测异位病灶中BrdU的表达情况,确定标记滞留细胞(The label-retaining cells,LRCs).通过免疫组化双染检测LRCs表面CD34和CD146的表达情况.结果 腺上皮和间质的BrdU初始大标记率分别为(69.89±0.78)%和(73.27±1.06)%,于第6周和8周时分别有约(2.07±0.19)%和(4.63±0.72)%的腺上皮和间质细胞仍保留标记,即为上皮和间质标记滞留细胞,多位于异位内膜与所种植的裸鼠组织的交界处.LRCs并不表达CD34,少数间质LRCs表达CD146.结论 异位子宫内膜中有上皮和间质两种干细胞,主要定位于异位内膜与所种植的组织的交界处,CD34不是异位内膜干细胞的标志物,CD146表达于异位内膜干细胞,但并非其特异性标志物.
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胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察
目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况.方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况.结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原.在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%.结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能.
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MTT还原法与BrdU标记法检测2BS增殖活性比较
目的建立MTT还原法测定2BS增殖活性的实验条件,并与BrdU标记检测法进行比较.方法借助酶标仪检测SiO2作用AM后的上清液刺激2BS增殖活性.结果两方法平行相关(r＞0.90).结论 MTT还原法较BrdU标记法简便、快速、价廉,更宜于推广和实用.
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内源性noggin对学习记忆过程中海马神经发生的调控作用
目的:探讨noggin对成年大鼠海马5溴-2脱氧尿苷(BrdU)表达与学习记忆相关性及长时程增强(long term potentiation,LTP)的影响.方法:侧脑室注射noggin反义寡核苷酸,BrdU标记结合免疫组化检测成年海马神经干细胞的增殖,刺激海马CA3区Schaffer侧支,在CA1锥体细胞层记录LTP.结果:侧脑室注射noggin反义寡核苷酸后,能明显抑制学习训练引起的海马齿回与颗粒细胞层BrdU免疫反应阳性细胞的增多效应,使齿回及颗粒细胞层BrdU阳性细胞数减少44.51%(t=82.57,P＜0.01)和40.04%(t=68.54,P＜0.01).LTP结果显示noggin反义寡核苷酸明显抑制LTP的诱出率,并使群集性峰电位(population spike,PS)的增幅与场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)斜率增加的百分率均较对照组显著减低(P＜0.01).结论:提示内源性noggin参与调控学习记忆过程中海马的神经发生.
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5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点及可行性
背景:骨髓干细胞移植成功的定性指标是标记移植的细胞至组织器官后存活并发挥了正常的功能.目前细胞学研究方面采用的标记方法有酶联标记、氚胸腺嘧啶核苷标记、荧光标记和5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记等.目的:观察5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的特点.设计:单一样本观察.单位:华北煤炭医学院附属医院心胸外科.材料:实验于2003-07/2004-12在华北煤炭医学院中心实验室完成.取月龄3个月的日本大耳白兔6只,雌雄不限,体质量(3.00±0.25)kg.方法:①利用密度为1 073 g/L的Percoll分离骨髓的单核细胞,以含体积分数为0.1的胎牛血清的低糖Dulbecco's改良的Eagle's培养基培养与扩增间充质干细胞,纯度可达95%左右.②用5-溴脱氧尿嘧啶核·苷标记骨髓间充质干细胞24,48,72,96 h后的检测标记率(标记组);阴性对照为未经5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞;空白对照为以磷酸盐缓冲液或正常鼠血清替代一抗.主要观察指标:①3组各检测200个细胞,并在不同时间点观察.②5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记的骨髓间充质干细胞免疫组织化学染色结果及细胞计数结果.结果:①标记组均见5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞,5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性反应物位于细胞核,呈棕色、颗粒状或弥漫性分布;对照组未见阳性细胞.②标记组24,48,72,96 h 5-溴脱氧尿嘧啶核苷阳性细胞的数目分别为48±2,100±4,173±2,178±3,随着标记时间的延长,标记率逐渐增高,标记72 h后标记率在85%以上.③阴性对照和空白对照组各时间点均为0.结论:①用5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞的佳时间是72 h.②标记后检测的敏感性好,在低倍镜中亦可见,适合于大块组织的定量研究.③结果表明5-溴脱氧尿嘧啶核苷标记骨髓间充质干细胞是可行的.
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成年大鼠脑损伤后神经前体细胞的增殖及迁移
背景:成年哺乳类动物中枢神经系统存有神经前体细胞,其基本生物学特性主要包括多向细胞分化和维持自身数量稳定.目的:观察中枢神经系统损伤后神经前体细胞增殖和迁移的反应过程,探讨神经前体细胞在中枢神经系统损伤修复中的作用,设计:随机对照实验.单位:北京市神经外科研究所病理生理研究室.材料:实验在北京市神经外科研究所病理生理研究室完成.选择成年Wistar大鼠67只,随机分为正常对照组7只,损伤后1,3,7,14,30 d组,每个损伤组12只.以上每个损伤组再随机分为人工脑脊液组2只,碱性成纤维细胞生长因子组5只和神经营养因子-3组5只.方法:各损伤组制作液压冲击性脑损伤模型,正常对照组仅开颅,不致伤.各损伤组每次腹腔内注射BrdU 50 mg/kg,处死前2 h注入后一次,其中损伤后1 d和3 d组每天注入3次,损伤后7 d和14 d组每天注入1次.碱性成纤维细胞生长因子组每日灌注碱性成纤维细胞生长因子总量360 ng,神经营养因子-3组每日灌注神经营养因子-3总量240ng,人工脑脊液组每日灌注液中不含碱性成纤维细胞生长因子和神经营养因子-3,灌注4 μL.免疫组织化学方法动态检测各组大鼠脑组织中Nestin和BrdU的表达.BrdU标记方法确定增殖的神经前体细胞;Nestin的表达用于确定神经前体细胞. 主要观察指标:Brdu,GFAP+/Brdu+和GFAP-/Brdu+在各组大鼠脑损伤不同时相中的表达.结果:67只大鼠均进入结果分析.①与正常对照组相比较,伤侧皮质、海马及室下区的Nestin阳性细胞数于伤后1 d明显增多[(3.1±1.1),0个/视野;(5.5 ±0.9),(1.3 ±0.8)个/视野;(8.1±0.9),(2.3±0.8)个/视野,P＜0.05],7 d达高峰[(7.5±1.2),(10.2±1.5),(13.6±1.2)个/视野],30 d消失[0,(1.2±0.9),(2.1±0.8)个/视野].②伤侧皮质、海马及室下区的BrdU阳性细胞数于伤后3 d达高峰[(12.6±1.5),(9.9±1.1),(13.4±1.0)个/视野],而7 d以后逐渐减少.③室下区BrdU阳性细胞及Nestin阳性细胞经胼胝体向对侧迁移.结论:液压冲击性脑损伤可激发成年大鼠脑皮质、海马及室下区神经前体细胞增殖及迁移,其中Nestin阳性细胞数于伤后7 d多,BrdU阳性细胞数于伤后3 d多.
