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环境水体中霍乱弧菌的二次PCR检测方法
目的 建立环境水体中霍乱弧菌的二次PCR检测方法.方法 对霍乱弧菌的外环境水监测样本进行PCR检测;确定弱电泳条带或无电泳条带的稀释度,将第一次PCR的产物梯度稀释后进行二次PCR.采用琼脂凝胶糖电泳进行分析.结果 对378件环境水样分别进行一次、二次PCR检测,有4件水样经两种方法检测均为阳性,有6件水样二次PCR检测为阳性.一次PCR检测霍乱弧菌的阳性率[1.06％(4/378)]低于二次PCR[2.65％( 10/378)],差异有统计学意义(P＜0.05).结论 二次PCR操作简便快速、检出率高、费用低廉,适用于环境水样中霍乱弧菌的快速监测.
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维甲酸核受体RARα真核表达载体的构建、突变纠正及表达
目的 构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,并检测其在人肺腺癌细胞A549中表达.方法 从小鼠巨噬细胞RAW264.7中提取总RNA,以RT-PCR法扩增RARα cDNA,克隆至真核表达载体pDsRed1-C1中,测序结果显示RARα第1040位A→G,导致其编码蛋白的氨基酸发生改变.通过二次PCR将其纠正,重组载体RedC1-RARα转化大肠埃希菌Top10,筛选阳性克隆做酶切及测序鉴定.脂质体瞬时转染A549细胞,在荧光显微镜下观察RARα的表达.RT-PCR法检测RARα的mRNA水平表达.结果 通过RT-PCR及二次PCR得到RARα cDNA,构建其真核表达载体,脂质体瞬时转染A549细胞得到了成功表达,RARα基因产物定位于细胞核内.结论 成功构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,且证实RARα编码蛋白定位于细胞核内,本研究结果为进一步探讨结核分枝杆菌固有免疫机制奠定了基础.
关键词： 维甲酸核受体 细胞内病原体抗性基因1 二次PCR 突变纠正 转染 -
多重二次PCR在微量DNA标本检验中的应用
目的:探讨用多重二次PCR扩增极微量DNA标本供后续SSCP和DNA测序分析.方法:对照组取微量组织提取的DNA为模板,分别用不同的4对引物各自行PCR,同一PCR反应体系里加入4对引物扩增.然后将此扩增产物稀释1 000倍为模板,再以相同引物进行第二次PCR.实验组:取微量组织提取的DNA为模板,以与对照组相同的4对引物各自进行PCR.用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果,用DNA测序方法检测二次PCR扩增产物的特异性.结果:微量的DNA标本可同时被多对引物二次扩增.实验组与对照组比较,各自引物扩增的DNA片段在琼脂糖凝胶电泳显示区带速率相同,测序显示碱基序列相同.结论:因极微量的DNA模板不能满足多引物多次PCR时,可用多重二次PCR扩增,本方法在法医学、考古和组织活检等方面将有广阔的用途.
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人白介素24 cDNA克隆、突变纠正和原核表达
目的 获取人白介素24(IL-24)cDNA,构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GST-IL-24.方法 以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板,RT-PCR扩增IL-24 cDNA,克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,测序结果显示在IL-24 cDNA第223位G→A,370位T→C,从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变:A75T,H124Y,通过二次PCR将其纠正,重组载体pGEX-IL-24转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE,Western blot检测显示有融合蛋白GST-IL-24表达.结果 通过RT-PCR及二次PCR得到人IL-24 cDNA,构建其原核表达载体,经IPTG诱导在相对分子量约为50 000处有融合蛋白表达.结论 IL-24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GST-IL-24融合蛋白.
