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维甲酸核受体RARα真核表达载体的构建、突变纠正及表达
目的 构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,并检测其在人肺腺癌细胞A549中表达.方法 从小鼠巨噬细胞RAW264.7中提取总RNA,以RT-PCR法扩增RARα cDNA,克隆至真核表达载体pDsRed1-C1中,测序结果显示RARα第1040位A→G,导致其编码蛋白的氨基酸发生改变.通过二次PCR将其纠正,重组载体RedC1-RARα转化大肠埃希菌Top10,筛选阳性克隆做酶切及测序鉴定.脂质体瞬时转染A549细胞,在荧光显微镜下观察RARα的表达.RT-PCR法检测RARα的mRNA水平表达.结果 通过RT-PCR及二次PCR得到RARα cDNA,构建其真核表达载体,脂质体瞬时转染A549细胞得到了成功表达,RARα基因产物定位于细胞核内.结论 成功构建维甲酸核受体RARα真核表达载体,且证实RARα编码蛋白定位于细胞核内,本研究结果为进一步探讨结核分枝杆菌固有免疫机制奠定了基础.
关键词： 维甲酸核受体 细胞内病原体抗性基因1 二次PCR 突变纠正 转染 -
细胞内病原体抗性基因1的原核表达
目的 构建细胞内病原体抗性基因1(Intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达.方法 以pMD19-T simple-Ipr1质粒为模板,采用PCR法扩增Ipr1基因,克隆至表达载体pET-32a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+ )-Ipr1,转化大肠杆菌BL21( DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确；表达的重组Ipr1蛋白相对分子质量约为70 000,以1.5 mmol/L IPTG诱导4h,目的蛋白的表达量高,约占菌体总蛋白的16％,重组Ipr1蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合.结论 成功构建了Ipr1基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组Ipr1蛋白,为进一步探讨Ipr1蛋白的功能及Ipr1重组BCG的构建奠定了基础.
关键词： 结核病 细胞内病原体抗性基因1 原核细胞 基因表达 -
Ipr1重组卡介苗对小鼠结核病的治疗效果
目的 评估携带小鼠胞内病原体抗性基因1(intracellular pathogen resistance 1,Ipr1)质粒(pBOGI)的重组卡介苗(BCG)对结核分枝杆菌(Mtb)感染的治疗效果.方法 BALB/c小鼠30只,随机分为3组:分别滴鼻给予磷酸盐缓冲液(PBS)、BCG和重组BCG,2周后用人型Mtb H_(37),Rv标准株感染所有小鼠;感染后分别用PBS、BCG和重组BCG治疗7次;末次治疗后处死小鼠,检测肺脾荷菌量,肺脾脏器指数,血清IFN-γ、IL-10及TNF-α分泌水平和肺脾组织中Ipr1的表达,同时观察小鼠肺脾组织病理改变情况.结果 重组BCG组肺脾荷菌量比PBS组和BCG组显著降低(P<0.01);重组BCG组肺脾脏器指数比PBS组和BCG组显著降低(P<0.05);重组BCG组血清IFN-γ分泌水平比PBS组和BCG组显著升高(P<0.01).用免疫组化检测到小鼠肺睥组织中有Ipr1表达.PBS组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛;重组BCG组肺部病变轻,肺泡结构基本正常;BCG组病变范围局限,病变程度界于PBS组与重组BCG组之间;各组间比较脾脏病理改变不明显.结论 携带小鼠Ipr1基因的重组BCG对结核分枝杆菌感染有一定的治疗作用.
关键词： 细胞内病原体抗性基因1 结核分枝杆菌 卡介苗 -
稳定表达细胞内病原体抗性基因1的RAW264.7细胞克隆的建立
目的:构建携带细胞内病原体抗性基因1(Ipr1),以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体,并导入鼠巨噬细胞RAW264.7中表达.方法:Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切重组质粒pET32a(+)-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,Ipr1基因定向克隆入pEGFP-C1载体,构建重组质粒载体pEGFP-C1一Ipr1.脂质法转染体培养的RAW264.7细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1-Ipr1融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测Ipr1基因转录水平的表达;West-ern Blot方法验证Ipr1蛋白水平的表达.结果:酶切鉴定获得一条约4700 bp卒载体条带及一条约1338 bp目的片段,证明pEGFP-C1-Ipr1真核表达载体构建成功.pEGFP-C1-Ipr1转染RAW264.7细胞后,Western Blot可以检测到约Mr 77×103的融合蛋白在RAW264.7细胞中表达,荧光显微镜下可观察纠转染细胞中有绿色荧光蛋白表达.结论:成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-Ipr1,获得稳定的RAW264.7-Ipr1细胞克隆可表达Ipr1,为进一步研究lpr1的功能奠定了基础.
关键词： 细胞内病原体抗性基因1 转染 脂质体 细胞克隆
