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环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体
目的：建立逆转录（RT）-环介导等温扩增方法（LAMP），以快速检测手足口病重要的两种病原体：肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）。方法：收集手足口病患儿咽拭子标本93份，针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物，分别于63℃（EV71）、65℃（CA16A）扩增1 h，日光下观察结果，与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果：EV71、CA16的LAMP低检测限均为500拷贝/管，与对照病毒无交叉反应。93份标本中，RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例，CA16阳性36例；RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例，CA16阳性36例，两种方法间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。结论：应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高，适合在基层医疗机构推广应用。
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应用逆转录-环介导等温扩增技术检测乙型肝炎病毒RNA方法的建立
目的 建立逆转录-环介导等温扩增(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法 检测乙型肝炎病毒(HBV)RNA,为乙型肝炎抗病毒治疗安全停药的研究提供技术支持.方法从NCBI数据库下载HBV A～D型,通过序列对比选出S区保守序列设计LAMP引物;提取HBV血清样本RNA与DNA,用RT-LAMP、LAMP进行检测;通过对非特异模板扩增实验验证扩增特异性;通过倍比稀释的HBV-RNA模板,用RT-PCR法与RT-LAMP法检测以评价灵敏性.结果 经过特异性实验证明LAMP特异性高,未检测到非特异性扩增.RT-LAMP的灵敏性为5×103 IU/ml,RT-PCR的灵敏性为5×101 IU/ml.用RT-LAMP与LAMP检测RNA与DNA证明了HBV-DNA检测不到后,HBV-RNA仍存在.结论 本研究针对HBV S区保守序列,设计了针对我国主要的4种HBV基因型(A、B、C、D)LAMP通用引物,从而建立了检测HBV-RNA的RT-LAMP新技术,有助于为应用核苷类似物的乙型肝炎患者安全停药标志物的研究提供技术支持.
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肠道病毒71型环介导等温扩增检测方法的建立
目的:采用一步逆转录-环介导等温扩增(Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification,RTLAMP)肠道病毒71型(EV71)特异性基因,以建立一种快速、敏感、经济的EV71检测方法.方法:针对EV71病毒VP1基因特异性序列的8个区域设计6条环介导等温扩增引物,Bst(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶63℃扩增目的基因1h,GoldView染色,日光下观察结果,并评价其特异性和灵敏度.结果:该方法与柯萨奇病毒A16型、轮状病毒、诺如病毒无交叉反应发生.建立的RT-LAMP检测方法灵敏,低检测限为50拷贝/管,比定量PCR灵敏10倍.93份咽拭子标本中,RT-LAMP检测示46份阳性,实时荧光定量PCR检测示44份阳性,经卡方检验分析,两者间无显著统计学差异.结论:RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、经济的方法,适用于基层医疗机构临床检测普及.
关键词： 逆转录-环介导等温扩增技术 肠道病毒71型 手口足病 -
基于颜色判定的环介导等温扩增方法检测EV71
建立了一种基于颜色判定的灵敏、快速和经济的逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)方法应用于肠道病毒71 (enterovirus 71,EV71)基因检测.针对EV71病毒VP1基因特异性序列的设计出6条特异引物,在等温条件下(63℃)进行扩增反应60 min.在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,以其颜色变化作为结果判断标准.进行特异性／灵敏度分析,同时与RT-PCR方法进行比较,并对93份疑似患者中咽拭子的病毒核酸进行了检测.通过颜色变化能观察到LAMP扩增产物的存在,且与柯萨奇病毒A16型(CA16)、轮状病毒、诺如病毒无交叉反应发生.所建立的RT-LAMP检测方法灵敏,灵敏度为500 copy/tube,与定量PCR灵敏度相同.93份咽拭子标本中,RT-LAMP检测为46份阳性,荧光定量PCR检测有为44份阳性,二者统计学无显著差异.RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、经济的方法,适合用于基层医疗机构临床检测.
关键词： 逆转录-环介导等温扩增技术 肠道病毒71型 手足口病 -
基于逆转录-环介导等温扩增技术快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立
目的 建立1种快速、特异、灵敏的发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)的检测方法.方法 针对SFTSV M基因保守区域的核酸序列,设计逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)特异性引物,优化反应体系和条件.用毛细管电泳法和横向流动试纸条(LFD)法检测扩增产物,建立RT-LAMP检测方法.进行敏感性、特异性检验,并与Real-time RT-PCR法进行比较.结果 以LFD法和毛细管电泳法检测RT-LAMP扩增产物具有相同的敏感性和特异性;RT-LAMP-LFD检测SFTSV的敏感性为10 copies RNA分子/反应,且与其他病毒无交叉反应.RT-LAMP-LFD和Real-time RT-PCR检测临床标本阳性率差异无统计学意义(P＞0.05),2种方法一致性好(Kappa=0.918).结论 建立的RT-LAMP方法快速、简单、操作简单,具有较高的敏感性和特异性,适合应用于基层单位和现场SFTSV的快速检测.
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逆转录-环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条法快速检测肠道病毒
目的 建立一种快速特异敏感的肠道病毒检测方法.方法 针对肠道病毒保守区基因序列,设计6条逆转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)特异性引物,经过优化,用毛细管电泳及横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立RT-LAMP-LFD检测方法,并与荧光定量PCR法进行比较.结果 LFD与毛细管电泳法检测特异的RT-LAMP扩增产物具有同样的敏感度,RT-LAMP-LFD法检测肠道病毒与其他病毒无交叉反应,低检出限为10拷贝RNA分子,与荧光定量PCR法检测结果一致性为99.2％.结论 建立的RT-LAMP-LFD方法,具有较高的特异性及灵敏度,操作简单、快速且不需要昂贵的仪器设备,适合应用于基层实验室肠道病毒的快速检测.
关键词： 肠道病毒 逆转录-环介导等温扩增技术 横向流动试纸条 快速检测 -
逆转录-环介导等温扩增快速检测EV71病毒
目的 建立一种检测肠道病毒71型(EV71)快速、敏感的一步逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)方法.方法 针对EV71病毒VP2基因特异性序列的6个区域设计4条LAMP引物,建立RT-LAMP检测方法,并评价其特异性和灵敏度.结果 通过GoldView染色和凝胶电泳均能观察到LAMP扩增产物的存在,且与柯萨奇病毒A16型(CA16)无交叉反应发生.所建立的RT-LAMP检测方法灵敏,低检则限为1.0×102 copies/mL.RT-LAMP检测的41份咽拭子标本中有27份出现EV71阳性反应,与荧光定量PCR结果一致.结论 RT-LAMP是一种快速、敏感、特异、准确的方法,适合用于基层医疗机构临床检测.
关键词： 逆转录-环介导等温扩增技术 肠道病毒71型 快速诊断
