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转染人热休克蛋白70对同种异体移植心脏移植物血管病的影响
目的 探讨经冠状动脉内灌注重组腺病毒载体介导HSP70(Ad.HSP70)转基因治疗对同种异体心脏移植物血管病的影响.方法 以套管技术建立颈部异位异种心脏移植模型.基因转移组在体外经冠状动脉缓慢灌注含3.8×1010 VP/ml Ad-HSP70 的4 ℃HTK液,持续45 min;空白载体组灌注含3.8×1010 VP/ml不携带基因腺病毒空白载体(Ad)的HTK液(B组);对照组仅灌注无病毒的HTK液(A组)持续同样时间.术后1个月收集移植物组织做检测.组织内目的基因表达产物通过免疫分析、RT-PCR进行半定量分析,免疫组化染色进行定性和定位分析.结果 RT-PCR证实,移植物内外源性HSP70基因转录,免疫组化检测证实Ad-HSP70转染的移植物(C组)HSP70成功转到血管周围的心肌细胞和冠状动脉微血管,HSP70表达水平明显高于其他两组(P＜0.01).HSP70过量表达减少NF-κB的活化及VCAM-1的表达,HSP70过量表达的移植物内炎症细胞浸润数明显减少,巨噬细胞和NK细胞浸润减少,移植物血管内皮损伤轻.结论 经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导保护性自稳蛋白-人热休克蛋白70基因转移到心脏移植物是相当有效可行的,并可减轻移植物冠脉内皮损伤,预防移植物血管病.经冠状动脉灌注重组腺病毒载体介导基因转移在移植物内局部表达有潜力的治疗制剂,此方法具有广阔的临床应用前景.
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hMAM融合HSP70基因真核表达载体的构建及其免疫学活性测定
目的 构建融合人乳腺珠蛋白(hMAM)与人热休克蛋白70(HSP70)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,为乳腺癌的基因治疗奠定基础.方法 采用PCR法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,与人HSP70基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建重组载体pcDNA3.1-hMAM-HSP70,采用电穿孔法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA法检测目的 基因的表达.结果 成功扩增HSP70与hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM与人HSP70的融合基因,COS-7细胞中可检测到hMAM表达;重组质粒免疫小鼠可诱导产生抗HSP70抗体.结论 hMAM与人HSP70融合基因的真核表达载体构建成功;此为进一步进行乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.
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B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-ScFv和人Hsp70的制备及其抗瘤效应
背景与目的:恶性B型淋巴细胞表面免疫球蛋白(surface membrane immunoglobulin,Smlg)表达的独特型决定簇(Idiotypic determinant,Id)不仅是该类肿瘤特异性标记,也是该类肿瘤的特异性抗原,可诱导机体对其产生特异性免疫应答,但由于Id是自体成分,分子量小.免疫原性较弱.人热休克蛋白70(heat shock protein.Hsp70)是一类重要的抗原提呈分子,能有效加强抗原肽的免疫原性.本研究通过制备慢性B型淋巴细胞性白血病(B-cell chronic lymphatic leukemia,B-CLL)患者瘤细胞膜表面独特型单链抗体(Idiotypic determinant single-chain antibody.Id-ScFv)和Hsp70两种蛋白,在体外研究两者联合抗瘤作用并初步探讨其机制.方法:分别在大肠杆菌中表达Id-scFv和Hsp70两种蛋白.表达产物经SDS-PAGE电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis)及ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay)检测鉴定后,分别用金属螯合层析和离子交换层析纯化并在体外将这两种蛋白结合成复合物(Hsp70-Id).用MrTT法及检测Id-ScFv组、人Hsp70组及Hsp70-Id组刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖作用,以ELISA法检测各组培养上清中IL-12和TNF-á水平.并用流式细胞术检测各组PBMC亚群的变化.用活细胞计数法检测各组被激活的PBMC对慢性B细胞白血病细胞株Daudi、慢性髓性白血病细胞株K562和肝癌细胞株HepG2的杀伤作用.结果:经SDS-PAGE电泳分析纯化后表达产物的分子量大约为30 ku(Id-ScFv蛋白)和70 ku(Hsp70蛋白).分别与其理论预期值相符.PBMC的增殖作用、培养上清中IL-12和TNF-a水平.Hsp70-Id组明显强于Id-ScFv组和人Hsp70组(P＜0.05).而Id-ScFv组和人Hsp70组明显强于阴性对照组(P＜0.05).流式细胞术检测显示在Hsp70-Id组、Id-scFv组和人Hsp70组PBMC中CD8+T细胞亚群的百分率均有增加.其中Hsp70-Id组明显.在Id-ScFv组和Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用较K562、HepG2细胞强(P＜0.05).且Hsp70-Id组激活的PBMC对Daudi细胞的杀伤作用明显强于Id-ScFv组(P＜0.001).结论:成功获取B-CLL患者瘤细胞膜表面Id-scFv和人Hsp70两种纯化蛋白:Hsp70-Id在体外可增强PBMC的特异性杀瘤作用,其机制可能与促进PBMC的增殖、活化CD8+T细胞并诱导具有抗肿瘤作用的Th1型细胞因子的分泌有关.
关键词： 慢性B淋巴细胞性白血病 表面独特型单链抗体 人热休克蛋白70 -
广西省白裤瑶族人群心理应激状况及其对热休克蛋白70的影响
目的 探索广西白裤瑶族地区人群心理应激状况及其对人热休克蛋白70 (Heat Shock Protein 70,HSP70)的影响.方法 采用随机整群抽样法,应用生活事件量表(LES)、简化症状自评量表(SCL-90)、和社会支持评定量表(SSRS)对广西南丹县白裤瑶和壮族人群324人进行问卷调查,同时应用ELISA法测量血样中HSP70的含量.结果 (1)调查对象的生活事件总分≥20分占32.41％,心理问题阳性检出率为26.12％;社会支持总均分为(8.55±1.69)分.壮族人群的焦虑水平为(1.66±0.69)分,高于白裤瑶族(1.43±0.42)分(P＜0.05). (2)被试者HSPT0表达水平在(1.43±0.15) Lg/ml范围,不同民族之间差异有统计学差异. (3)全体调查对象HSP70表达水平与年龄(r=-0.211,P＜0.05)和焦虑呈负相关(r=-0.216,P＜0.05);与文化程度(r=0.318,P＜0.001)和社会支持呈正相关(r=0.181,P＜0.05);采取分层回归分析对文化程度和年龄进行变量控制,壮族人群的社会支持对HSP70表达呈正相关影响(β=0.263).结论 广西白裤瑶人群的心理应激和心理卫生状况不容乐观,HSP70表达与焦虑和社会支持等心理因素有相关性.
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MAGE-1与人HSP70融合基因真核表达载体的构建及在小鼠黑色素瘤细胞内的表达
目的:构建MAGE-1(melanoma antigen 1)与人HSP70(heat shock protein 70)融合基因的真核表达载体PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70,并观察在小鼠黑色素瘤细胞内的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.方法:HSP70基因经酶切后连入真核表达载体PIRES2-EGFP,再通过PCR方法扩增MAGE-1基因,测序后插入PIRES2-EGFP-HSP70中HSP70基因的5端,构建了MAGE-1与人HSP70融合基因表达载体PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70.结果:扩增了MAGE-1基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致,成功地构建了PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70真核表达载体.结论:成功地构建MAGE-1与人HSP70融合基因的真核表达载体PIRES2-EGFP-MAGE-1-HSP70,并在小鼠黑色素瘤细胞系稳定表达,为进一步DNA肿瘤疫苗研究提供了实验基础.
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MAGE-1与人HSP70融合基因真核表达载体的构建
目的:构建MAGE-1(melanoma antigen 1)与人HSP70(heat shock protein 70)融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.方法:利用PCR方法扩增人HSP70基因,经测序后连入真核表达载体pCDNA3.1,再通过PCR方法扩增MAGE-1基因,测序后插入HSP70基因的5′端,构建了MAGE-1与人HSP70融合基因表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70.结果:成功地扩增了人HSP70基因与MAGE-1基因,测序结果表明与GenBank公布的序列一致,成功地构建了pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70真核表达载体.结论:成功地构建MAGE-1与人HSP70融合基因的真核表达载体pCDNA3.1-MAGE-1-HSP70,为进一步DNA肿瘤疫苗研究提供了实验基础.
