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提高Lipofectamine2000对PC12细胞转染效率的研究
目的 探讨提高PC12细胞转染效率的方法.方法 细胞培养板用10 μg/mL Ⅰ型牛胶原蛋白包被,通过在转染过程中加入9 μmol/L趋溶酶体试剂氯喹及8μmol/L聚胺类试剂亚精胺,同时调整Lipofectamine2000与DNA用量的比例和转染时间.考察DNA与Lipofectamine2000的比例对PC12细胞转染效率的影响,转染时间对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺用量对PC12细胞转染效率的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞活性的影响,氯喹、亚精胺对PC12细胞神经轴突生长的影响及与4种常用脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率的比较.结果 ①对PC12细胞转染,DNA:Lipofectamine2000用量比例应控制在1∶4.②当转染时间分别为1、2、4、8、24 h时,PC12细胞转染率分别为35.5％、37.9％ 、40.5％、40.3％及38.6％,4h达到大转染效率.③氯喹、亚精胺加入浓度的增加,PC12细胞转染效率随之增加,当氯喹、亚精胺加入终浓度分别增至9μmol/L和8μmol/L时,PC12细胞的转染效率高,转染效率为40.5％.④加入终浓度为9μmol/L氯喹与8μmol/L亚精胺前、后MTT试验吸光度(590 nm)分别为(0.466±0.042)与(0.451±0.038),差异无统计学意义(P＞0.05),对PC12细胞的活性无影响.⑤加入氯喹、亚精胺前、后,PC12细胞的神经轴突生长数量与长度差异无统计学意义(P＞0.05).⑥FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000 4种脂质体转染试剂对PC12细胞转染效率分别为10.5％、8.6％、11.8％及15.3％,本法PC12细胞转染率为40.5％,差异有高度统计学意义(P＜0.01).结论 加入氯喹及亚精胺,实现阳离子脂质体Lipofectamine2000对PC12细胞的高效转染,为PC12细胞进行神经细胞基因功能及开发遗传病治疗方案等生物学研究提供了一种安全、廉价的新方法.
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阳离子脂质体转染Hela细胞的实验冰
背景;基因载体是基因治疗中重要的影响因素,阳离子脂质体细胞毒性低,转染效率高,是一种很有前景的基因转染载体.目的:评价两种阳离子脂质体介导基因转染宫颈癌细胞的转染效果,优化它们对宫颈癌细胞的转染条件.设计、时间及地点:以Hela细胞为观察对象,分组设计.实验于2008-03/06在大连民族学院生命科学学院国家民委一教育部重点实验室完成.材料:质粒pGFP.N2购自Clontech公司,Hela细胞由大连民族学院的实验室保存.方法;.首先采用DNA延滞实验考察阳离子脂质体与DNA的结合能力,然后用进行细胞转染实验研究脂质体的转染效率,后通过四甲基偶氮唑盐法考察脂质体对细胞的毒性.主要观察指标:采用DNA延滞实验观察阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA的结合能力,以报告基因(绿色荧光蛋白基因pGFP-N2),分析阳离子脂质体Lipofectamine 2000和DOTAP转染Hela细胞转染效率和细胞毒性.结果:Lipofectamine 2000和DOTAP与DNA均有很强的结合力:以绿色荧光蛋白基因为报告基因,Lipofectamine 200C转染率较高;当Lipofectamine 2000与DNA质量比为3:1时,转染效率高,约72%,是DOTAP转染细胞高活性的2.5倍;在佳转染剂量时,2种试剂的细胞存活率均在75%以上,Lipofectamine 2000的毒性相对较小.结论:对Hela细胞而言,Lipofectamine 2000较DOTAP具有更高的转染效率和较低的细胞毒性.
关键词： Lipofectamine2000 转染 细胞毒性 Hela 阳离子脂质体 -
pEGFP-N1-NUCB2真核表达质粒的构建及在SH-SY5 Y细胞中的转染效率
目的 构建pEGFP-N1-NUCB2重组子并比较Lipofectamine 2000和Xfect两种转染试剂在进行神经细胞转染时的转染效率.方法 构建pEGFP-N1-NUCB2重组子,然后采用碱裂解法进行质粒DNA的提取,PEG-MgCl2进行质粒DNA的纯化,后将纯化的质粒DNA分别用两种不同转染试剂分别在HEK293细胞和SH-SY5Y细胞中进行转染.结果 采用Lipofectamine 2000进行pEGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验,发现在HEK293细胞中可以转染成功,但是在SH-SY5Y细胞中基本没有荧光显现;采用Xfect进行pEGFP-N1-NUCB2重组子的转染实验,发现在SH-SY5Y细胞中虽有荧光显现,但是转染效率非常低.结论 Xfect的转染效率高于Lipofectamine 2000,pEGFP-N1-NUCB2在SH-SY5Y细胞中采用脂质体进行转染很难成功.
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大鼠胚胎原代海马神经元两种转染方法的比较
目的:原代海马神经元是原代细胞中比较难转染的细胞,为了得到比较高的转染效率,通过比较Li-pofectamine2000转染法和大鼠神经元核电转法(rat neuron nucleofector kit)转染效率及转染前后细胞的存活率,来探讨Nucleofector Kit核电转法的高效性.方法:选取胚胎18 d (E18)大鼠的海马神经元进行原代培养,获取海马神经元单细胞悬液后,于种植前和种植24 h后分别采用Nucleofector Kit和Lipofectamine 2000转染红色荧光蛋白(red fluorescence protein,DsRed)质粒.神经元转染48 h后分别采用轴突标记物Tau -1进行免疫荧光染色鉴定神经元.神经元的存活率采用台盼兰进行检测.结果:Lipofectamine2000的基因转染率仅为5.34％,而大鼠神经元Nucleofector Kit的转染率为44.54％,后者为前者的8.34倍.Lipofectamine2000转染细胞前后的存活率分别为98.56％和91.44％,而Nucleofector Kit组分别为98.26％和74.02％.结论:大鼠神经元核电转法能高效稳定的转染原代海马神经元.
