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pTAT-HA质粒转化菌保存效果的实验研究
目的 探讨保存pTAT-HA质粒转化菌简单有效的方法 .方法 配制LB细菌培养基,将pTAT-HA质粒转化至DH5α感受态细胞,筛选成功转化子并扩增培养,将转化菌接种在不同浓度甘油菌液和新鲜牛奶中,-70℃保存6个月和1年后分别复苏,计算存活率,分析保存效果.结果 保存6个月以30%甘油、40%甘油和新鲜牛奶保存效果较好,保存1年仅见30%甘油、40%甘油和新鲜牛奶冻存管有存活菌.结论 pTAT-HA质粒转化菌宜使用30%～40%甘油菌液或新鲜牛奶保存.
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pTAT-HA质粒载体在受体菌DH5α中的转化及鉴定
目的 探索pTAT-HA质粒在受体菌DH5α中转化的方法 .方法 配制LB培养基,将pTAT-HA质粒转化至DH5α,培养筛选成功转化子,电泳鉴定.结果 pTAT-HA质粒转化菌可在Amp+LB培养基中生长,电泳结果 显示质粒大小准确无误(约3000 bp).结论 pTAT-HA质粒转化成功,转化菌可冷冻保存质粒,提取的质粒可用于下游分子生物学实验.
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大肠杆菌甲基化缺陷DM1菌株与普通DH5α菌株的感受态转化率的比较
目的 观察甲基化缺陷的大肠杆菌DM1菌株与普通DH5α菌株感受态转化效率的差别.方法 用常规氯化钙法制备二者的感受态细胞,质粒转化后计算转化率.结果 DM1菌株感受态细胞转化率为(2.2±0.3)×106 CFU/μg,DH5α菌株感受态细胞转化率为(6.3±0.5)×106 CFU/μg.结论 成功建立一种高效制备甲基化缺陷菌株DM1感受态细胞的方法,虽然该法制备DM1感受态细胞转化效率比DH5α低2-3倍,但其能够高效满足质粒克隆实验中Dam或Dcm甲基化的限制性位点的使用要求.
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hTERT干扰真核表达载体的构建及鉴定
目的构建和鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)干扰真核表达载体.方法人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到siRNA(small interfereace RNA)真核表达载体pSilencer 3.1-H1 neo;采用PCR、酶切和测序鉴定.结果成功构建了hTERT干扰真核表达载体.结论hTERT干扰真核表达载体的构建为进一步研究端粒、端粒酶在肿瘤细胞中的生物学作用奠定了基础.
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经基因改造大肠杆菌DH5对裸鼠结肠癌肝转移灶的治疗效果
目的:利用"与"门(AND gate)方法对缺氧敏感的甲酸脱氢酶基因操纵子、能感知细胞密度差异的lux基因转录启动子、白喉毒素基因等基因进行构建,导入NTG诱导的减毒营养缺陷型DH5α大肠杆菌(Ecoli DH5α),注射入荷瘤鼠,观察其对结肠癌肝转移灶的作用.方法:先构建质粒,然后导入诱变后DH5α大肠杆菌,注射入10只裸鼠体内,观察其毒性.后对20只结肠癌肝转移的荷瘤鼠注射后观察疗效.结果:注射野生型DH5α大肠杆茵10只裸鼠均死亡,而注射营养缺陷型DH5α大肠杆茵只有1只死亡,与未转染质粒的营养缺陷型DH5α大肠杆菌相比,注射含质粒的营养缺陷型DH5α大肠杆菌荷瘤鼠的癌转移灶大小明显小于对照组.结论:含"与"门质粒的营养缺陷型DH5α大肠杆菌安全,对结肠癌肝转移荷瘤鼠有明显趋向性及治疗作用,可为临床治疗做一新探讨.
