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手足口病合并脑炎患儿172例临床分析
目的：通过分析商丘市2009年4月至8月份手足口病合并脑炎住院患儿的临床特征，以期找到预测手足口病危重后果的临床及实验室指标，以便早期进行临床干预，指导临床治疗。方法收集172例手足口病合并脑炎患儿的完整资料，比较临床症状及实验室检查的异同。结果手足口病合并脑炎的患儿外周血白细胞计数、脑脊液细胞数无显著性差异，而在发热持续时间、血糖水平、肌钙蛋白、发病年龄有显著性差异。结论发病年龄小、发热持续时间长、高血糖、末梢循环不良、精神差、肢体抖动、呕吐、易惊可能是重症手足口病的高危因素。
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手足口病诊断中肠道病毒71型核酸与抗体检测的应用意义探究
目的：研究探讨肠道病毒71型（EV-71）核酸和抗体联合检测在手足口病诊断中的应用价值。方法选取我院收治的已确诊为手足口病患者1036例作为研究对象，分别对其进行 EV-71核酸与抗体检测，计算单独行 EV-71核酸检测和抗体检测的阳性率及联合检测的总符合率。同时，对两种检测方法的一致性进行分析，判断其吻合程度。结果1036例手足口病患儿单独行 EV-71核酸检测和单独行抗体检测的阳性率分别为72.9％和72.5％，两种方法诊断阳性率比较，差异无统计学意义（χ2＝0.04，P ＞0.05）。其中，两者全阳性的比例为69.6％，全阴性的比例为24.2％。EV-71抗体核酸检测与 EV-71抗体检测的总符合率为93.8％（972／1036），对其进行一致性分析（Kappa ＝0.98，P ＜0.01），提示两种方法具有较高吻合性。结论EV-71核酸和抗体都是临床诊断手足口病的有效方法，联合检测可发挥互补优势，降低早期漏诊率，为患儿后续治疗提供可靠依据。
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荧光恒温扩增技术检测肠道病毒71型方法的建立与评价
目的：利用荧光恒温扩增（SAT）技术建立一种快速可靠的肠道病毒71型（EV71）检测方法。方法通过设计特异性的 EV71 RNA 扩增引物及优化探针技术，使用 M-MLV 反转录酶及 T7 RNA 多聚酶对 EV71 RNA进行核酸扩增，同时利用荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪进行实时的荧光信号收集和检测。检测复旦大学附属儿科医院儿童手足口病患儿粪便样本199例，以 EV71型核酸检测试剂盒作参比方法，DNA 测序为第三方验证方法，对研究数据进行 Kappa 一致性分析。结果SAT 技术共检测到119例 EV71阳性样本，其中21例荧光探针法检测为阴性，经测序证实20例样本仍为阳性。SAT 与荧光探针法检测结果的 Kappa 值为0．789。SAT 方法的敏感性100％、特异性98．77％。结论本研究建立的 EV71型 RNA SAT 技术具有敏感性高、特异性强、准确、快速可靠等优点，适用于临床对 EV71感染的快速诊断。
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木犀草素对肠道病毒71型感染细胞的影响
目的：探讨木犀草素体外抗肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）感染的机制。方法：分别用0、25、50、100、200、400μg ／mL 木犀草素处理人横纹肌肉瘤（RD）细胞，48 h 后检测细胞存活率；另将 RD 细胞分为对照组（常规培养）、木犀草素组（25、50、100μg／mL）、EV71感染组和木犀草素（25、50、100μg／mL）＋EV71感染组，于病毒感染48 h后，MTT 法检测各组细胞存活率，流式细胞术检测细胞凋亡，蛋白质印迹法检测 Caspase-3表达，ELISA 法检测细胞TNF-α，IL-β，IL-6和 IL-10浓度。结果：与0μg／mL 相比，25、50、100μg／mL 木犀草素对 RD 细胞存活率无明显影响（P ＞0．05）；25、50和100μg／mL 木犀草素＋EV71感染组 RD 细胞存活率均明显高于 EV71感染组（P 均＜0．05）；与EV71感染组相比，木犀草素＋EV71感染组细胞凋亡率和 Caspase-3表达明显降低，TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-10分泌明显减少（P 均＜0．05）。结论：木犀草素可能通过抑制细胞凋亡和减少促炎症因子分泌，抑制 EV71对细胞的感染。
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肠道病毒71型3CD 蛋白对细胞的损伤作用
目的：研究肠道病毒71型（EV71）3CD 蛋白在致病机制中的作用。方法实验分为对照组、SDLY1组、SDLY107组和 SDLY107（1-3CD）组。通过反向遗传技术将弱毒株 SDLY1株的3CD 蛋白编码区置换到强毒株SDLY107株，形成拯救病毒 SDLY107（1-3CD）株。将 EV71病毒接种于 RD 细胞和 Vero 细胞，于37℃和39．5℃孵育一定时间后，采用 MTT 试验检测活细胞量，以判断病毒对细胞损伤作用的改变。结果37℃下，拯救病毒SDLY107（1-3CD）对细胞的损伤作用弱于 SDLY107株，但仍强于 SDLY1株（P ＜0．05）；39．5℃下，拯救病毒SDLY107（1-3CD）株对细胞的损伤作用较 SDLY107株下降（P ＜0．05），但与 SDLY1株的差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论EV713CD 编码区的置换可以改变病毒对细胞的损伤作用，3CD 蛋白编码区可能存在影响病毒毒力的位点。这一发现有助于理解 EV71的致病机制。
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肠道病毒71型手足口病280例临床分析
目的：对肠道病毒71型（EV71）手足口病患者的临床特征进行分析。方法选取安阳市第五人民医院2013年2月至2014年2月收治的280例 EV71型手足口病患者作为研究对象，对其临床资料进行回顾性分析，总结其临床特征。结果4、5、6、7、11、12月份收治患者分别占16%、25%、21%、7.5%、8.5%、11%，市区、农村患者各占34%、66%，症状累及神经系统、呼吸系统、循环系统各占45.7%、8.2%、14.6%，无皮疹及口腔疱疹患者5例，肝功能、心肌酶异常、白细胞计数、血糖升高各占30%、39%、34.6%、17.5%。280例患者经早期干预有10例遗留不同程度后遗症，2例自动出院，余均治愈或好转出院。结论肠道病毒71型手足口病多发于4~7月份，11、12月份会有小高峰，农村患者高于城市患者，并发症主要累及神经系统、循环系统和呼吸系统，警惕无皮疹患者病情进展，对重症病例早期识别是降低病死率的关键。
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手足口病病原学及检测方法研究进展
手足口病可由多种肠道病毒引起，其中以肠道病毒71型和柯萨奇病毒 A16型为流行，各种亚型之间交替出现。早期诊断对患儿的及时治疗、预后改善具有重要意义。目前，其病原学的实验室检测方法主要包括病毒分离培养、反转录 PCR、实时荧光定量 PCR、反转录环介导等温扩增、酶联免疫吸附试验、中和抗体试验等。现就手足口病病原学及其检测方法的研究现状作一综述。
关键词： 手足口病 肠道病毒 71 型 柯萨奇病毒 A16 型 检测方法 -
湘潭市手足口病原学流行特征分析
目的：针对湘潭市20102013年手足口病监测实验室检测结果分析该病病原学流行特征，为本市手足口病防控提供参考依据。方法：收集湘潭市20102013年国家疾病监测报告管理系统手足口病疫情基本资料及实验室检测结果进行统计分析；实验室检测采用 RT-PCR 实时荧光法检测肠道病毒、肠道病毒71型（EV71）、柯萨奇病毒 A 组16型（CoxA16）.结果：20102013年，检样1079份，肠道病毒阳性569例，阳性率52.73％；EV71型阳性211份，占37.08％，；CoxA16阳性110份，占19.33％；其他型阳性248份，占43.59％；997份轻症病例中 EV71阳性率30.12％、CoxA16阳性率22.09％、其他型阳性率47.79％；重症病例67份，EV71阳性率84.48％、其他型率15.52％；死亡病例15份，EV71阳性率92.31％、其他型率7.69％。结论：2010-2013年，湘潭市手足口病以 EV71型和其他型为优势流行株；重症、死亡病例主要由 EV71引起；EV71型引起的手足口病比其他肠道病毒更容易引起流行，导致重症的比例也较高。
关键词： 手足口病 肠道病毒 肠道病毒 71 型 柯萨奇病毒 A 组 16 型 -
肠道病毒71型感染并发神经源性肺水肿与神经细胞凋亡的关系
目的：探讨肠道病毒71型（ EV71）感染并发神经源性肺水肿与神经细胞凋亡的关系。方法收集9例 EV71重症感染并发肺水肿死亡患儿（感染组）以及同期7例未感染 EV71而出现肺水肿、肺出血等并发症死亡患儿（对照组）的临床资料，对患儿尸体系统解剖，对脑、心、肺进行原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法检测凋亡细胞，光镜下观察。结果感染组各器官病理学检查可见脑组织有局部软化灶及卫星现象，肺组织可见肺泡腔塌陷，部分肺泡腔内充满水肿液，心肌组织均未见明显异常。对照组各器官脑组织及心肌组织未见异常，肺泡组织可见肺泡腔内存在粉红色均质水肿液。感染组各器官均检测到凋亡细胞，阳性检出率100％。感染组脑组织细胞凋亡明显，凋亡指数高，与感染组心肌组织和肺泡组织比较，差异均有统计学意义（P ＜0．01）；感染组心肌组织及肺泡组织均可见少量凋亡细胞，凋亡指数较低，差异无统计学意义（P ＞0．05）；对照组各器官均出现少量凋亡细胞，各器官间比较差异无统计学意义（P ＞0．05），与感染组相对应各器官进行比较，除脑组织差异有统计学意义（P ＜0．05）外，心、肺差异均无统计学意义（P ＞0．05）。结论EV71重症感染并发肺水肿可引起大量神经细胞凋亡。
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肠道病毒71型 VP1基因的扩增、克隆、表达及蛋白分析
目的：对肠道病毒71型 VP1基因片段进行扩增、克隆、生物信息学分析、原核表达、纯化，初步证实重组表达产物的生物学活性。方法根据 GenBank 中 EV71序列设计一对特异性引物，以 EV71患者咽拭子标本中提取病毒核糖核酸为模板， RT-PCR 扩增 EV71 VP1基因，酶切后插入表达载体 pET28a。构建 pET28a-EV71 VP1原核表达载体。转化 E．coli DH5α，IPTG诱导表达，使用 SDS-PAGE 及 Western blot 分析表达结果，利用软件对测序结果进行生物信息学分析。纯化蛋白并包被反应板，用 ELISA 分别检测 EV71阳性与 COX A16阳性患者 VP-1 IgG 抗体，进行统计学分析。结果目的基因经 BLAST 比对，同源性与 GenBank 登录号为 JQ766207．1 EV71 VP1一致性达99％。EV71 VP1蛋白相对分子质量约为32×103，主要以包涵体形式存在。生物信息学分析得出，EV71 VP1蛋白为亲水性蛋白，无跨膜区，不具有 N-端信号肽序列，存在三级结构。ELISA 结果显示EV71阳性患者 OD 值为（2．425±0．521），COX A16阳性患者 OD 值为（1．205±0．314），健康对照组 OD 值为（0．353±0．128）。EV71 VP1蛋白检测敏感性和特异性分别为84％和88％。结论成功构建了 pET28a-EV71 VP1表达载体；通过对手足口患者血清进行 ELISA 初步分析，得出目的蛋白有较高的敏感性和特异性，初步证实具有生物学活性，可进一步用于 EV71诊断及疫苗的相关研究。
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IL-6和 IL-13与 EV71型肠道病毒感染手足口病患者发病的相关性
目的：观察肠道病毒71型(EV71)感染手足口病(HFMD)患者血清白细胞介素(IL)-6和 IL-13水平变化情况及其临床意义,并对血清 IL-6和 IL-13细胞来源进行初步的探讨。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定 HFMD 患者和健康对照血清中 IL-6和 IL-13水平,比较不同严重程度的 HFMD 患者血清中 IL-6和 IL-13水平,并同时检测 HFMD 患者治疗后血清IL-6和 IL-13水平变化情况。流式细胞术(FCM)分析外周血单个核细胞(PBMC)中单核细胞分泌 IL-6和 T 细胞分泌 IL-13的情况。EV71病毒感染健康人单核细胞和 T 细胞后,FCM 检测单核细胞分泌 IL-6和 T 细胞分泌 IL-13变化情况。结果EV71感染 HFMD 患者血清 IL-6和 IL-13水平分别为(79.63±29.45)pg/mL 和(36.45±15.13)pg/mL,健康对照组血清 IL-6和 IL-13水平分别为(27.26±7.82)pg/mL 和(13.46±3.14)pg/mL,HFMD 患者血清 IL-6和 IL-13水平显著高于健康对照者(P <0.01),同时,随着 HFMD 患者疾病严重程度增加,血清 IL-6和 IL-13水平亦逐渐升高(P <0.01)。治疗后 HFMD 患者血清中 IL-6和 IL-13水平分别为(48.23±23.14)pg/mL 和(23.25±9.63)pg/mL,与治疗前相比显著降低(P <0.01)。HFMD 患者外周血单核细胞分泌 IL-6水平和 T 细胞分泌 IL-13的水平与健康对照者相比显著升高；EV71病毒处理健康人单核细胞和 T 细胞后单核细胞和 T 细胞分泌 IL-6和 IL-13能力显著升高。结论EV71病毒可能时通过促进单核细胞分泌 IL-6和 T 细胞分泌 IL-13,致使血清 IL-6和 IL-13水平升高,从而参与 HFMD 的发生和发展。
