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侵袭性牙周炎患者抗伴放线聚集杆菌血清c型IgG滴度分析
目的：分析侵袭性牙周炎（aggressive periodontitis， AgP）患者血清中的抗伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans， Aa）血清c型IgG抗体滴度及其影响因素。方法：采集62例AgP患者（18例切磨牙型，44例广泛型）和45例牙周健康者的空腹静脉血，同时收集AgP患者的龈下菌斑和非刺激性全唾液用于Aa的检测（ PCR方法），应用酶联免疫吸附方法测定血清中抗Aa血清c型IgG抗体滴度。结果：AgP组和健康对照者血清中的抗Aa血清c型IgG抗体检出率均为100％， AgP 组的抗体滴度为11．1±1．9，显著高于健康对照组（9．1±1．8， P＜0．01）。切磨牙型AgP患者的抗Aa血清c型的IgG抗体滴度和抗体升高率与广泛型比较差异无统计学意义。唾液或龈下菌斑样本 Aa 检出阳性的 AgP 患者抗体滴度显著高于Aa 阴性患者（11．9±1．3 vs．10．7±2．1， P＜0．05）。结论：Aa血清c型为我国AgP患者定植的Aa的重要血清型，广泛型AgP患者血清抗Aa抗体滴度与切磨牙型AgP患者无明显差异。
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伴放线聚集杆菌表面相关物质通过Fas-FasL诱导T淋巴细胞凋亡的体外研究
目的 检测在伴放线聚集杆菌表面相关物质(SAM)诱导下,T细胞上Fas-FasL的表达情况.方法 选取健康受试者10名,抽取静脉血,提取外周血中单核细胞(PBMC),用SAM体外刺激PBMC,用单克隆抗体(Fas、FasL)进行标记,上流式细胞仪进行检测.结果 Fas和FasL的表达量明显升高.细胞培养24h,实验组Fas表达量为24.61±2.82,96h为66.67±3.18.在24h,FasL的表达量为5.46±1.28,而96h为22.14±2.25.抗Fas单克隆抗体明显阻滞Fas-FasL相互作用,终导致凋亡T淋巴细胞数目减少至21.2±2.95,未加抗体的为49.96±4.07.但残余的细胞凋亡活动仍比阴性对照组高.结论 Fas-FasL途径,在SAM诱导T淋巴细胞凋亡中起主要作用,并具有时间依赖性.
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实时荧光定量 PCR 检测牙周炎患者龈下菌斑的分布
目的：应用实时荧光定量 PCR 技术探索侵袭性牙周炎（aggressive periodontitis，AgP）、慢性牙周炎（chronic periodonti-tis，CP）患者龈下菌斑中伴放线聚集杆菌（A．actinomycetemcomitans，Aa）、牙龈卟啉单胞菌（P．gingivalis，Pg）的分布规律。方法采集32例 AgP、33例 CP、32例牙周健康者的龈下菌斑，构建含有2种待测细菌基因片段的重组质粒，建立定量标准，采用TaqManMGB 探针实时荧光定量 PCR 方法检测样本中细菌数量。结果本实验构建的引物及 TaqManMGB 探针特异性及敏感性较好。AgP 组龈下菌斑 Aa 的检出率高于 CP 组（P ＜0．01），但2种细菌数量在组间无显著差异，两组内 Pg 的检出率及数量都明显高于 Aa（P ＜0．001），另外 AgP 组 Aa 的数量、CP 组 Pg 数量与牙周探诊深度密切相关（P ＜0．01及 P ＜0．001）。结论龈下菌斑 Aa 的检出率可能与牙周炎类型存在一定关联，Aa 可能并不是中国人群样本 AgP 患者龈下菌斑的优势菌，实时荧光定量 PCR 对牙周病学研究有广泛应用前景。
关键词： 侵袭性牙周炎 慢性牙周炎 伴放线聚集杆菌 牙龈卟啉单胞菌 实时荧光定量 PCR -
基于iTRAQ技术的伴放线聚集杆菌细胞致死性扩张毒素诱导Jurkat细胞的凋亡研究
目的：探索伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans， A．a）的一种毒力因子（cytolethal distending toxin， CDT）诱导人T淋巴细胞发生凋亡过程中表达改变的信号分子。方法培养Jurkat细胞，并进行分组：不做处理的正常细胞对照组、野生型A．a CDT刺激Jurkat细胞的野生组、突变型A．a CDT刺激Jurkat细胞的突变组，应用iTRAQ技术检测A．a CDT作用Jurkat细胞24 h过程中表达差异蛋白。结果通过筛选，我们得到20个凋亡相关的蛋白（变化倍数＞1．3），其中表达上调的有8个（ CASP8／CD3E／YY1／SH3BGRL3／P53／CASP3／ UBE2I／ TNFRSF10B ），表达下调的有12个（ F5／RPL18A／DAD1／MTCH2／HIST1H1E／CNBP／RBM25／SLC16A1／KDM2A／CD99／RAC2／TMX1）。结论本研究检测出了伴放线聚集杆菌细胞致死性膨胀毒素诱导人 T 淋巴细胞凋亡过程中表达差异的蛋白，并筛选了一条可能的信号通路 UBE2I／P53／TNFRSF10B／CASP8／CASP3，为下一步研究及临床治疗局限型侵袭性牙周炎提供思路。
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伴放线聚集杆菌细胞致死性膨胀毒素介导人T淋巴细胞凋亡的实验研究
目的 通过研究伴放线聚集杆菌(aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)的一种毒力因子细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)诱导人T淋巴细胞发生凋亡过程中表达改变的相关基因,探索其凋亡过程中可能存在的相关信号调节通路,寻找侵袭性牙周炎诊断、治疗潜在的生物标记分子.方法 通过透射电镜和流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,荧光定量PCR检测CDT蛋白作用于人T淋巴细胞后凋亡相关基因表达的改变.结果 CDT蛋白作用于人T淋巴细胞24 h后,处理组细胞凋亡比例约为29.1％,对照组约为6.3％,透射电镜观察到典型的凋亡细胞的形态,如细胞体积缩小、染色质浓缩及边集等现象.荧光定量PCR结果显示促凋亡基因GADD45A、TNFSF8、TRADD、TNFRSF10B和TP53表达升高.结论 伴放线聚集杆菌CDT可以促进人T淋巴细胞的凋亡,在这一过程中相关的促凋亡基因表达增加.
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具核梭杆菌对牙龈卟啉单胞菌或伴放线聚集杆菌诱导多形核白细胞活性氧生成的影响
目的:探讨与具核梭杆菌(F.nucleatum,Fn)共同感染时,牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis,Pg)或伴放线聚集杆菌(A.actinomycetemcomitans,Aa)对多形核白细胞(PMNs)产生活性氧(ROS)的影响.方法:取健康人抗凝外周血,经Percoll分离后取PMNs,将分离的PMNs与2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)混合,于37℃的水浴箱中孵育15 min,然后分别向管中加入A组和B组细菌(细菌分组:A1,Pg;A2,Aa;A3,Fn;B1,Pg+Fn;B2,Aa+ Fn;B3,Pg+Aa;B4,Pg+ Aa+ Fn;B5,Aa+Pg+Fn),充分混合后于37℃孵育1h和4h,流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测PMNs产生ROS的量.结果:不同牙周致病菌与分离的PMNs在37℃作用1h,PMNs生成ROS的量分别是A1-16.52;A2-18.74;A3-19.59;B1-17.60;B2-20.09,其中B1＞ A1;B2＞A2,差异显著(P＜0.05).不同微生物与分离的PMNs在37℃作用4h,PMNs生成ROS的量分别是A1-176.05;A2-203.19;A3-230.36;B1-259.08;B2-274.89,其中B1＞A1;B2＞A2,差异显著(P＜0.05).结论:与Fn共聚后,Pg或Aa诱导PMNs产生ROS的能力被增强.
