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高效阴离子交换色谱法测定依诺肝素钠1,6-脱水衍生物含量
目的 建立依诺肝素钠特异性末端结构1,6-脱水衍生物结构的含量测定方法.方法 肝素酶混合液将依诺肝素钠水解成二糖或四糖单位,水解得到的寡糖峰经硼氢化钠还原后用-高效阴离子交换色谱法方法进行分析.采用Waters Spherisorb S5 SAX(4.0 mm x250 mm,5μm)色谱柱,以0.28 gL·-1磷酸二氢钠溶液为流动相A含0.28 g.L-1磷酸二氢钠及140 g·L-1高氯酸钠的溶液为流动相B进行梯度洗脱(0 ～ 20 min,3％～35％B;20-50 min,35％～100％B;50 ～ 60 min,100％B;60～61 min,100％～ 3％B,61～79 min,3％B),流速0.8 mL·min-1,柱温为50℃;检测波长为234 nm,并用归一化面积百分比法计算摩尔百分含量.结果 筛选出了酶解效果达标的国产肝素酶并优化了酶解条件,酶解后1,6-脱水△ⅠS-ⅠS与1,6-脱水△ⅠS峰面积比＜1.15;优化色谱条件后△ⅠA和1,6.脱水△ⅠS的分离度＞1.5;硼氢化钠还原后的溶液色谱图中,△ⅠS和还原△ⅠS的峰面积比均小于0.02;两家国产依诺肝素钠生产企业样品结果均在15％～25％内.结论 方法可对依诺肝素钠特征还原末端结构进行分离和定量,作为对低分子肝素进行微观结构分析的首个鉴别项目,已收载入新修订依诺肝素钠国家标准草案中.
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黄杆菌肝素酶Ⅱ的克隆与表达
目的 克隆并表达黄杆菌肝素酶Ⅱ(HepⅡ)的基因.方法 通过PCR从黄杆菌基因组DNA中扩增出黄杆菌HepⅡ的基因,经验证后插入到表达质粒pET-28a上构建表达载体,重组质粒转化E.coli BL21(DE3)进行蛋白质表达.结果 成功地将PCR扩增得到的测序正确的HepⅡ基因构建人pET-28a载体上,重组质粒转入E.coli BL21(DE3)后表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白,测活显示重组HepⅡ具有活性.结论 克隆并成功表达了黄杆菌HepⅡ基因.
