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利用细胞培养基或动物血浆中的荧光标记产物测定鞘磷脂合酶活性
鞘磷脂合酶(SMS)催化神经酰胺(ceramide,Cer.)转变为鞘磷脂(sphingomyelin,SM).近来的研究表明神经酰胺和鞘磷脂参与了代谢综合征的过程,因而鞘磷脂合酶被认为是开发抗代谢综合征药物的潜在靶点.鞘磷脂合酶有两个同工酶,分别称为鞘磷脂合酶1 (SMS1)和鞘磷脂合酶2(SMS2).这两种同工酶的亚细胞定位不同,在不同组织中的表达水平也有差异.到目前为止,己发表有多种方法测定组织和细胞匀浆中的总SMS活性,这些方法通过分析总反应体系或细胞内的酶促反应产物来衡量SMS活性.本文介绍一种测定SMS活性或筛选SMS抑制剂的新方法.我们将荧光标记的神经酰胺(NBD-Cer.)作为底物与细胞孵育,或者将该底物注射到小鼠体内,然后监测在细胞培养基或小鼠血浆中出现的荧光标记的鞘磷脂(NBD-SM)的含量.采用这种办法可有效检测出D609(一种鞘磷脂合酶抑制剂)对细胞和小鼠整体SMS活性的抑制作用.我们进一步采用该方法检测了SMS1基因敲除小鼠和SMS2基因敲除小鼠的SMS活性,结果发现注射底物后,SMS2基因敲除小鼠(而不是SMS1基因敲除小鼠)血浆中NBD-SM的堆积被明显阻断.因而该方法可用于检测生理或药理条件下在体或离体组织的SMS活性、筛选SMS抑制剂、甚至筛选SMS2特异性抑制剂.
关键词： 鞘磷脂合酶 酶活性测定 鞘磷脂合酶抑制剂筛选 鞘磷脂 神经酰胺 -
鞘磷脂合酶抑制剂对血管紧张素Ⅱ诱导的高血压小鼠心肌纤维化的影响
目的 研究鞘磷脂合酶抑制剂D609对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)诱导的心肌纤维化的影响.方法 将雄性野生型C57BL/6J小鼠28只,采用随机数字表区组分组法分为对照组、D609组、AngⅡ组和Ang Ⅱ+D609组,每组7只.通过持续皮下灌注Ang Ⅱ建立高血压模型,2周后观察小鼠的血压变化,行心脏超声评估心脏结构和功能.采用HE与Masson染色观察心肌纤维化.使用ELISA方法测定小鼠血浆中炎性反应因子、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)及白细胞介素(interleukin-6,IL-6)的浓度.结果 与对照组小鼠比较,Ang Ⅱ组小鼠血压出现显著升高和心肌肥厚,而且心肌纤维化明显增加,血浆中TNF-α及IL-6的浓度显著增加.与Ang Ⅱ组比较,Ang Ⅱ+D609组小鼠血压降低,心肌肥厚明显减轻,心肌及血管组织的胶原纤维沉积显著减少,且血浆TNF-α及IL-6的浓度显著降低.结论 鞘磷脂合酶在高血压导致的心肌纤维化中可能发挥重要作用.
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人鞘磷脂合酶干扰载体的构建与鉴定
目的 构建沉默人鞘磷脂合酶1 (SMS1)和鞘磷脂合酶2(SMS2)基因表达的重组干扰载体,为进一步研究人SMS1和SMS2基因与动脉粥样硬化及其他疾病发生的关系提供研究基础.方法 根据基因序列数据库中报道的人SMS1和SMS2基因序列及短发夹RNA (shRNA)设计原则,设计并合成用于构建人SMS沉默载体的DNA寡核苷酸,应用基因重组技术分别和线性化pSUPER干扰载体连接,构建了pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2重组干扰载体,并用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶同时处理重组载体pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2,随后测序,以鉴定重组干扰载体含有目的序列.同时为检测重组干扰载体对人SMS1和SMS2基因的干扰效率,本研究利用脂质体(Lipofectamine 2000)分别转染肝癌细胞HepG2,于48 h后分别检测HepG2细胞SMS1和SMS2mRNA的转录水平与SMS酶活(薄层层析法,TLC).结果 所筛选到的重组质粒pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后获得了281 bp DNA片段,且测序结果和理论设计的DNA寡核苷酸一致;随后检测转染HepG2细胞后SMS1和SMS2的mRNA表达水平.实验结果显示SMS1和SMS2的表达分别下降了45％和67％(P＜0.001,n=3),而TLC法的酶活结果检测显示,SMS1和SMS2干扰后的SMS酶活均有显著下降,分别下降了56％和63％(P＜0.001,n=3).结论 成功构建了人SMS1以及SMS2基因的沉默载体即pSUPER-SMS1和pSUPER-SMS2.
关键词： 鞘磷脂合酶 pSUPER干扰质粒 HepG2细胞 -
鞘磷脂合酶的生物学功能及与动脉粥样硬化的关系
鞘磷脂是细胞膜及血浆脂蛋白中的重要脂质,有着广泛而重要的生物学功能,并与动脉粥样硬化的发生发展密切相关,其含量改变已成为动脉粥样硬化的独立危险因素之一;而鞘磷脂合酶是鞘磷脂合成的关键酶,其表达水平及活性高低直接影响到动脉粥样硬化的病理过程,有可能成为动脉粥样硬化治疗的新靶点.该文就鞘磷脂合酶的结构、生物学功能、在动脉粥样硬化形成过程中的作用,及其作为AS治疗潜在靶点的研究近况进行了全面的综述.
