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新药研发过程中毒理学研究方法的进展--毒性的原因和早期毒性筛选
毒性已成为新药开发过程中淘汰的主要原因.近年来制药和生物技术工业的研究人员开发了多种新技术以便在药物发现和开发过程中尽早确定化合物的安全特性.笔者首先对药物毒性产生的原因如药靶的特异性、药物的分子结构、药物代谢和代谢动力学等方面进行了分析,再介绍了近几年早期毒性筛选的新技术,包括预测模型、体外高通量毒性筛选、活性代谢产物的检测、高内涵筛选技术、动物实验.
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基于高内涵筛选技术研究生首乌和制首乌醇提物的肝毒性机制
目的 应用高内涵筛选技术研究生首乌醇提物(RPM)和制首乌醇提物(RPMP)的肝毒性及其可能机制.方法 RPM(终浓度10,25,50,100,200和300 mg·L-1)和RPMP(终浓度10,50,100,300,600和1200 mg·L-1)作用于HepG2细胞3～24 h.采用CellTiter-GloTM荧光细胞活性检测试剂盒检测HepG2细胞存活率;应用高内涵筛选技术进行HepG2细胞计数,并检测线粒体内活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)、细胞内谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、转录激活因子4(ATF4)水平及细胞凋亡和细胞周期阻滞;Western蛋白质印迹法验证HepG2细胞SOD2和ATF4蛋白表达水平.结果 与细胞对照组相比,RPM 300 mg·L-1作用24 h使HepG2细胞存活率下降约48 ％(P＜0.01),而相同浓度RPMP对细胞存活率无显著影响;RPM和RPMP均能降低MMP (P＜0.05),并升高GSH,ROS,SOD2和ATF4水平(P＜0.05).与细胞对照组相比,RPM 200 mg·L-1作用3 h SOD2水平显著升高(P＜0.05),6 h ATF4水平显著升高(P＜0.05);RPMP 300 mg·L-1作用6 h ATF4水平显著升高(P＜0.05),24 h SOD2水平显著升高(P＜0.05).结论 RPM和RPMP均具有一定的细胞毒性,RPM的细胞毒性强于RPMP,两者的肝毒性可能主要与氧化应激和内质网应激导致的细胞凋亡有关.
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高内涵技术筛选抑制GH3细胞的天然黄酮类化合物的研究
目的 利用高通量的高内涵筛选(high-content screening,HCS)技术,从天然黄酮类化合物中筛选出对大鼠生长激素腺瘤GH3细胞具有生长抑制作用的化合物并对其作用机制进行初步探讨.方法 HCS技术检测13种天然黄酮类化合物处理GH3细胞24、48 h后细胞的生长形态及增殖活力.不同浓度的黄酮类化合物处理GH3细胞24 h后经Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪分析化合物诱导细胞凋亡的情况.结果 利用HCS技术从13种化合物中筛选出了对GH3细胞生长抑制效果显著的化合物异硫氰酸烯丙酯,该化合物能够时间依赖性地抑制GH3细胞增殖,并显著呈剂量依赖性地诱导GH3细胞凋亡.结论 HCS技术能直观清晰地观察药物对GH3细胞形态和细胞生长的影响,是一种体外大规模药物筛选的可靠技术方法.筛选出的化合物异硫氰酸烯丙酯可通过诱导细胞凋亡,抑制GH3细胞增殖.
关键词： 高内涵筛选技术 药物筛选 异硫氰酸烯丙酯 生长激素腺瘤GH3细胞 细胞增殖 -
肿瘤坏死因子-α诱导脂肪细胞胰岛素抵抗模型的建立及评价指标
[目的]确定运用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)建立胰岛素抵抗模型的适时间与剂量,并通过检测TNF-α对葡萄糖转运体4(GLUT4)表达及膜转位的影响探讨模型成立的评价指标.[方法]用不同浓度(5、10、15、20、25 ng/mL)的TNF-α作用于3T3-L1脂肪细胞不同的时间(48、72、96 h),建立胰岛素抵抗模型.另外,分别采用蛋白免疫印迹法(Western blot)和高内涵筛选技术检测模型组细胞GLUT4蛋白表达及分布情况.[结果]与对照组相比,10 ng/mL TNF-α作用3T3-L1脂肪细胞96 h后的模型组的葡萄糖摄取及GLUT4的表达均有显著的降低;加入胰岛素后,对照组的葡萄糖摄取及GLUT4的表达有明显的升高,而模型组无明显变化;胰岛素抵抗模型中,GLUT4膜转位显著降低,差异有统计学意义.[结论]10 ng/mL的TNF-α作用3T3-L1脂肪细胞96 h有利于建立胰岛素抵抗模型.此外,葡萄糖摄取结合GLUT4的蛋白表达及膜转位可作为胰岛素抵抗模型建立的评价标准.
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高内涵筛选技术及其在药学研究中的应用
随着显微成像技术、数据分析软件及染色技术等的飞速发展,高内涵筛选已成为能够以细胞为研究对象,单次检测获取多靶点数据的检测系统,目前正逐渐被应用到细胞生物学多个领域,并将在未来的药物研发中发挥重要作用.介绍高内涵筛选的3个技术基础,概述目前该技术在药学研究中的应用情况,并对其发展前景及应用中存在的问题进行了讨论.
