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E3连接酶HUWE1与真核翻译起始因子eIF4E的相互作用
为研究真核翻译起始因子eIF4E的调控,利用酵母双杂交系统从人骨髓cDNA文库筛选eIF4E相互作用蛋白质,核苷酸序列分析及同源性检索表明,其中一个约为0.4 kb的克隆与HUWE1 (HECT,UBA和WWEdomain containing 1,又称ARF-BP1,HECTH9,HUWE1)高度同源.细胞免疫共沉淀实验结果显示,在哺乳动物细胞水平能够检测到eIF4E蛋白与全长HUWE1的特异相互作用.利用构建好的含有HECT结构域的突变体进行相互作用位点研究,结果表明HUWE1的HECT结构域可以与eIF4E蛋白相互作用.
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糖氧剥夺/再灌注促进L2．3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达
目的：建立L2．3神经干细胞糖氧剥夺/再灌注损伤模型,探讨糖氧剥夺/再灌注是否可以促进L2．3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达。方法将L2．3神经干细胞糖氧剥夺6h,根据不同组别再灌注培养8h、16、24h,建立L2．3神经干细胞/再灌注损伤模型。将体外培养的L2．3神经干细胞分成5组：正常对照组( control组)、糖氧剥夺组( OGD)、糖氧剥夺/再灌注8h 组( OGD6h + R8h 组)、糖氧剥夺/再灌注16h 组( OGD6h + R16h 组)、糖氧剥夺/再灌注24h 组(OGD6h+R24h组)。 Control组：该组L2．3神经干细胞不进行糖氧剥夺处理。 OGD组：该组L2．3神经干细胞仅仅进行糖氧剥夺6h。 OGD6h+R8h 组：该组L2．3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养8h。 OGD6h+R16h组：该组L2．3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养16h。 OGD6h+R24h组：该组L2．3神经干细胞经历OGD6h后再灌注培养24h。结果与Control组比,OGD组L2．3神经干细胞糖氧剥夺6h后,活细胞比例明显减少[(94．15±3．59) vs (56．05±5．01),P<0．01]；与OGD前比,OGD6再灌注8h Huwe1蛋白表达开始增加,OGD6h再灌注16h和OGD6h再灌注24h Huwe1蛋白表达量显著增加,Huwe1蛋白表达的条带明显变粗变浓,OGD6h再灌注16h明显。结论糖氧剥夺可引起L2．3神经干细胞损伤；糖氧剥夺/再灌注可以促进L2．3神经干细胞内源性Huwe1蛋白表达。
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Huwe1-shRNA靶向沉默L2.3神经干细胞的Huwe1表达
目的 探讨Huwe1-shRNA通过慢病毒载体转染L2.3神经干细胞,是否可以靶向沉默L2.3神经干细胞的Huwe1基因.方法 将体外培养的L2.3神经干细胞分成3组:huwe1-shRNA未转染组(control组)、阴性序列转染组(control shRNA组)、huwe1-shRNA转染组(Huwe1 shRNA组).Control组:仅常规体外培养L2.3神经干细胞.不将阴性序列和Huwe1-shRNA通过慢病毒载体转染L2.3神经干细胞.Control shRNA组:阴性序列通过慢病毒转染体外培养的L2.3神经干细胞.Huwe1 shRNA组:Huwe1-shRNA通过慢病毒载体成功感染体外培养L2.3神经干细胞.分别收集三组体外培养的L2.3神经干细胞,应用western blot方法分别检测三组L2.3神经干细胞Huwe1蛋白的表达.结果 与control组、control shRNA组比,Huwe1shRNA组体外培养的L2.3神经干细胞huwe1蛋白表达条带显著减弱、变细(P＜0.05).与control组Huwe1蛋白的相对表达量比,Huwe1shRNA组Huwe1蛋白的相对表达量是control组的25％(P＜0.05).与control组比,control shRNA组和Huwe1shRNA组在慢病毒载体转染L2.3神经干细胞,L2.3神经干细胞存活率无明显下降(P＞0.05) 结论 Huwe1 shRNA通过慢病毒载体转染L2.3神经干细胞,可以靶向沉默L2.3神经干细胞Huwe1基因,却不影响L2.3神经干细胞的存活率.
