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犬组织匀浆中乌头碱的高效液相色谱-质谱测定法及体外稳定性研究
目的 建立了犬组织匀浆中有毒生物碱乌头碱的高效液相色谱-质谱测定法,并应用该方法考察了乌头碱在犬主要组织匀浆中的代谢稳定性.方法 色谱柱为C18柱,流动相为含有5 mmol/L甲酸铵和0.2％甲酸的乙腈和水,梯度洗脱.三重四级杆串联质谱配备电喷雾电离源(ESI),正离子模式下以选择离子监测进行检测.乌头碱分别与犬的肝、小肠、胃和肾的组织匀浆温孵,温孵后不同时间点取出,加入内标西酞普兰,乙腈沉淀后取上清液直接进样测定.结果 乌头碱浓度在5～500 ng/ml峰面积和内标的比值与浓度呈良好的线性关系；方法的回收率为85.73％～92.12％,其日内、日间的RSD值分别为5.32％ ～ 8.95％和5.45％～8.86％.体外孵育2h后,在犬肝、小肠匀浆中有约20％的乌头碱进行了代谢转化,其t1/2分别为460.6和521.3 min.但在胃和肾中几乎无变化.结论 研究提示犬体内的乌头碱主要在小肠、肝脏中代谢转化,但其代谢和清除较慢.
关键词： 乌头碱 体外代谢稳定性 HPLC-MS/MS -
鱼精蛋白模拟肽的体外代谢稳定性和代谢酶表型研究
目的 建立鱼精蛋白模拟肽(简称R15)的超效液相色谱(UPLC)检测方法,并应用于其体外代谢性质的研究.方法 BioBasic C18(2.1 mm×100 mm,5μm)色谱柱,流动相为0.05％三氟乙酸-水和0.05％三氟乙酸-乙腈(98:2,V/V),使用10％三氟乙酸-乙腈-水作为沉淀剂;研究了R15在不同种属大鼠全血中及大鼠肝、肾匀桨中的体外稳定性;将R15与大鼠全血和17种蛋白水解酶抑制剂在体外温孵,研究参与降解R15的蛋白水解酶类型.结果 UPLC方法的批内、批间精密度(RSD)均<15％,准确度(RE)为±15％,全血中R15在25～1000μg/ml范围内线性关系良好(r>0.9996),R15的提取回收率为99.4％～100.4％,在各实验贮存条件下R15稳定.R15在大鼠肝、肾匀浆、大鼠全血、比格犬全血和人全血中的半衰期分别为27.4、9.1、15.6、11.9和21.0 min;与不加蛋白酶抑制剂的对照组相比,实验组中加入EDTA、抑肽素、盐酸苯甲脒蛋白酶抑制剂的抑制率分别为92.7％、41.3％和33.0％,表明金属羧肽酶是R15主要的代谢酶,AEBSF、亮肽素、胰蛋酶抑制剂等蛋白酶抑制剂组抑制率较低,推测其可能参与R15的代谢.结论 该法专属性强、准确、可靠,R15在肾中代谢快,R15在大鼠全血中的代谢与金属羧肽酶有关.
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体外代谢在新药早期评价中的应用与发展
药物代谢研究与新药研发中的诸多环节密不可分,包括候选化合物的设计与先导化合物的筛选等.药物代谢研究一般分为体内代谢研究与体外代谢研究.与体内代谢研究相比,体外代谢研究可直接观察候选化合物与受试靶点的选择性作用,不需要消耗大量的样品和实验动物,操作快速简便,适用于代谢信息不明确的候选化合物进行高通量筛选.目前,体外代谢研究已被广泛应用于新药的早期代谢评价中,主要涉及代谢稳定性、代谢酶亚型鉴定以及代谢性相互作用等.本文就体外代谢研究在上述三方面的具体应用进行归纳总结,为中国创新药物实施“早期评价、早期淘汰”的研究策略提供参考.
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采用UPLC-MS/MS法研究辣薄荷基厚朴酚在不同种属肝微粒体中的代谢特征
目的:建立测定肝微粒体孵育体系中辣薄荷基厚朴酚浓度的方法,并探讨其在不同种属肝微粒体中的代谢特征.方法:分别将辣薄荷基厚朴酚溶解于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)启动的人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒体孵育体系中,置于37℃水浴中进行孵育,分别于孵育的0、2、5、10、15、20、30、45、60 min时用甲醇终止反应,以厚朴酚为内标,采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定各孵育体系中辣薄荷基厚朴酚的质量浓度.色谱柱为Acquity UPLCTM CSH C18,流动相为0.1％甲酸溶液-甲醇(梯度洗脱),流速为0.3 mL/min,柱温为30℃,进样量为2μL;离子源为电喷雾离子源,以多反应监测模式进行正离子扫描,用于定量分析的离子对分别为m/z 401.2→331.1(辣薄荷基厚朴酚)、m/z 265.1→247.0(内标).以孵育0 min时辣薄荷基厚朴酚的质量浓度为参照,计算其在不同孵育体系中的药物剩余百分比、体外代谢半衰期(t1/2)和固有清除率(CLint).采用化学抑制剂法探讨辣薄荷基厚朴酚的代谢途径;在上述色谱条件下,采用一级全扫描以正离子方式检测,初步分析其体外代谢产物.结果:辣薄荷基厚朴酚质量浓度检测的线性范围为3.91～500.00 ng/mL,定量下限为3.91 ng/mL;日内、日间RSD均小于10％,准确度为87.40％～103.75％,基质效应不影响待测物的测定.辣薄荷基厚朴酚在人、大鼠、小鼠、犬肝微粒体中代谢明显,而在猴肝微粒体中代谢不明显;孵育30 min后,其在各种属肝微粒体的药物剩余百分比趋于稳定.辣薄荷基厚朴酚在人、大鼠、小鼠、猴、犬肝微粒体中的t1/2分别为12.07、17.68、17.59、216.56、61.88 min,CLint分别为0.115、0.078、0.079、0.006、0.022 mL/(min·mg).细胞色素P450(CYP)2A6、CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9、CYP2E1、CYP1A2酶对该化合物代谢的抑制率分别为55.76％、93.94％、96.01％、93.69％、71.81％、23.25％、28.04％.辣薄荷基厚朴酚在人肝微粒体中两个主要代谢产物的准分子离子峰分别为m/z 441.2([M+Na]+)、m/z 337.2([M+H]+).结论:本研究建立的UPLC-MS/MS法简便、快速、专属性强,可用于肝微粒体孵育体系中辣薄荷基厚朴酚浓度的测定及药动学的研究.该化合物在人、大鼠、小鼠、猴、犬等5种肝微粒体中的代谢特征有差异,且其代谢过程可能与CYP2D6、CYP2C19、CYP3A4、CYP2C9等酶有关.
