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Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定
目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.
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尿激酶与重组组织型纤溶酶原激活剂静脉溶栓治疗急性心肌梗死的疗效比较
目的 比较尿激酶(UK)与重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓治疗急性心肌梗死的效果.方法 急性心肌梗死患者72例,借助SAS统计分析系统,按随机数字表法分为rt-PA组和UK组,每组36例.记录两组患者冠脉血管再通率、出血事件、不良心血管事件和病死率,并测定两组患者的肌钙蛋白T(cTnT).结果 rt-PA组患者溶栓开始后0.5h、1h、2h冠脉血管再通率均显著高于对照组,差异有统计学意义(x2 =7.32、6.12、5.81,均P＜0.05).rt-PA组出血事件3例、病死2例,UK组出血事件5例、病死3例,差异无统计学意义(x2=1.22,均P＞0.05).rt-PA组共出现不良心血管事件6例,对照组14例(x2=4.56,P＜0.05).rt-PA组病死2例,UK组死亡3例,两组病死率差异无统计学意义(x2=0.40,P＞0.05).两组患者cTnT在入院6h、12h时均较入院时有显著升高(t=6.67、6.30、4.11、4.22、4.40,均P＜0.05),两组比较,rtPA组在入院6h、12 h时cTnT显著低于UK组(t=5.92、6.61,均P＜0.05).结论 相比UK,rt-PA治疗急性心肌梗死再通率高,不良事件少,心肌损伤小,值得临床推广应用.
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EGFP-Cre重组酶真核表达重组质粒的构建及表达
目的 构建噬菌体P1 Cre重组酶真核表达重组质粒,检测其在体外的表达情况和生物学活性.方法 利用分子克隆技术,将cre编码序列克隆到真核表达质粒pIRES2-EGFP上,构建为重组质粒pCMV-Cre-EGFP.行菌液PCR、BamHⅠ酶切及测序鉴定,用FuGENE 6介导转染293T细胞,应用荧光显微镜和流式细胞仪观察分析Cre重组酶的表达和重组效应.结果 经菌液PCR、酶切及测序等鉴定分析,证实已将目的片段cre插入pIRES2-EGFP的多克隆位点上;建立Cre(+)组(pCMV-Cre-EGFP和含Loxp-CMV-RFP-Loxp的pCSilencer质粒)和Cre(-)组(pIRES2-EGFP和pCSilencer),转染293T细胞,48 h后荧光显微镜下可见2组均表达绿色荧光和红色荧光,Cre(+)组的红色荧光少于Cre(-)组;流式细胞仪检测荧光蛋白表达率,统计学分析显示2组细胞的红色荧光蛋白表达率存在显著性差异(P＜0.01).结论 成功构建噬菌体P1Cre重组酶表达重组质粒,并能在体外表达具有活性的Cre重组酶.
