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葡萄糖预处理对大鼠心肌细胞糖毒性损伤的保护作用
目的 探讨葡萄糖预处理对原代心肌细胞在高糖诱导的糖毒性损伤中的保护作用及其可能机制.方法 模拟体内高糖状态建立SD乳鼠原代心肌细胞高糖模型,设置对照组、高糖模型(HG)组和预处理(PG)组,对照组给予常规培养基(DMEM,5mmol/L D-glucose)培养6d,HG组给予高糖(50mmol/L D-glucose)培养96h,PG组在建模前给予葡萄糖预处理(10mmol/L D-glucose)4h,循环3次,每次预处理间隔为常规培养(DMEM,5mmol/L D-glucose)4h.采用MTS实验检测心肌细胞活性,TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡率,JC-1染色法检测线粒体膜电位,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3的表达水平.结果 MTS检测结果显示,HG组心肌细胞活性明显低于对照组(P<0.01),而与HG组相比,PG组心肌细胞活性有所增强(P<0.05).TUNEL检测结果显示,HG组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01),而与HG组相比,PG组心肌细胞凋亡率明显降低(P<0.05).JC-1检测结果显示,HG组线粒体膜电位明显低于对照组(P<0.05),而与HG组相比,PG组心肌细胞线粒体膜电位明显升高(P<0.05).Western blotting检测结果显示,与对照组比较,HG组Bcl-2表达减少,Bax、caspase-3表达增多,而与HG组相比,PG组Bax、caspase-3表达减少,Bcl-2表达增多,差异均有统计学意义(P<0.05).在上述各指标中,对照组与PG组比较差异均无统计学意义(P>0.05).结论 葡萄糖预处理能够增强细胞活性、减少细胞凋亡、减轻线粒体损伤,从而减轻高糖对心肌细胞的糖毒性损伤.
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金线莲醇提物在斑马鱼中降血糖效果的探究
目的 以斑马鱼为模型筛选金线莲具有降血糖效果的活性组分,并进行初步的机理研究.方法对金线莲进行分离与提取,分成三个组分:金线莲醇提物、大分子多糖(≥5×103)和小分子多糖(＜5×103).将发育至24 h的斑马鱼胚胎暴露于2%浓度的葡萄糖溶液(2% Glu)中,模拟急性高糖模型,待胚胎发育至48 h时再分别加入三种组分,同时继续用2%葡萄糖溶液处理,72 h时检测不同组分处理后幼鱼的组织液葡萄糖含量,筛选出具有降血糖效果的活性组分.利用半定量PCR和整胚原位杂交技术检测糖代谢相关基因mRNA水平的表达.结果 本研究利用高糖胁迫构建斑马鱼糖尿病模型,在该模型下,糖代谢关键因子胰岛素基因( preproinsulin, insulin)、磷酸烯醇式羧基酶 1 基因(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1, pck-1)、胰腺十二指肠同源盒基因 1 (pancreatic and duodenal homeobox 1, pdx-1)的表达都发生了明显改变,金线莲醇提物能够改善这些基因在高糖胁迫下引起的的异常表达,甚至恢复到正常水平.结论 金线莲醇提物对斑马鱼高糖模型具有明显的降血糖功效,该研究为斑马鱼作为糖尿病模型用于探索降血糖药物提供了实验思路和手段.
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Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型葡萄糖浓度和培养时间的筛选
目的 筛选Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型的葡萄糖浓度及培养时间.方法 取出生1～3 d Wistar大鼠分离视网膜神经元进行传代培养,尼氏染色法鉴定细胞;实验分5组:A组培养液葡萄糖浓度为0 mmol·L-1(正常对照组),B组浓度为10 mmol·L-1,C组浓度为15 mmol·L-,D组浓度为25 mmol·L-1,E组浓度为35 mmol·L-1.分别培养24 h、48 h、72 h后用MTT法检测各组细胞OD值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果 倒置显微镜观察分离培养细胞,大部分细胞于接种24h后贴壁,少数细胞长出较短的突起,并有向中央聚集生长的现象.2～3d后长出突起的神经元数目增多,突起长度增加,约为自身胞体长度的1倍.培养5～7d后神经元突起进一步增多、变长.经尼氏染色后细胞质呈蓝紫色,尼氏小体颗粒状结构清晰.非神经元细胞胞质基本不着色,细胞核呈淡紫色、圆形,核仁清晰可辨,神经元率达91％.各实验组在培养24h后OD值均低于正常对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05).随培养时间延长OD值继续下降,48 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P＜0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P＞0.05);D组OD值明显下降,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05),E组下降更明显,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.01).72 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P＜0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P＞0.05);D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P＜0.01).各组在培养24h后视网膜神经元凋亡率差异无统计学意义(P＞0.05).48 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P＜0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P＞0.05);D组凋亡率明显升高,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.05);E组凋亡率升高更明显,与A组比较差异有统计学意义(P＜0.01),且与D组比较亦有统计学意义(P＜0.05).72 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P＜0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P ＞0.05),D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P＜0.01).结论 葡萄糖浓度为25 mmol·L-1培养48 h是视网膜神经元高糖模型佳葡萄糖浓度及干预时间.
关键词： 大鼠视网膜神经元细胞 高糖模型 葡萄糖浓度 培养时间 -
视网膜血管内皮细胞高糖模型糖浓度及培养时间的筛选
目的:筛选Wistar大鼠视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVEC)高糖模型糖浓度及培养时间.方法:取出生1～3d的Wistar大鼠,分离RVEC进行原代培养,Ⅷ因子抗体免疫组化鉴定细胞;设立葡萄糖浓度0mmol/L为正常对照组(C组),按不同葡萄糖浓度依次分为10mmol/L(A组)、15mmol/L(B组)、25mmol/L(D组)、35 mmol/L(F组),分别在24、48、72h的3个时间点用MTT法检测各组细胞OD值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率.结果:RVEC纯度达94％;MTT法检测不同浓度葡萄糖对Wistar大鼠RVEC的影响:培养24h,各组的OD值比较差异无统计学意义(F=0.42,P=0.7411);培养48h,五组OD值比较差异有统计学意义(F=45.2,P=0.000),五组间两两比较,除A组、B组、C组间差异无统计学意义外(Q48AB=44.0427,Q48AC=36.4701,Q48BC=27.7953,均P＞0.05),其余各组两两比较差异均有统计学意义(其中Q48CF=11.0715,Q48AF=14.0794,Q48AF=12.2964,Q48BD=23.4698,Q48BF=12.7016,Q48DF=10.2013,均P＜0.05;Q48CF=6.4701,P＜0.01).培养72h后,五组OD值比较差异有统计学意义(F=37.46,P=0.000),五组间两两比较,同样A、B、C三组间差异无统计学意义(Q72AB=27.7338,Q72AC=25.0054,Q72BC=33.3797,均P＞0.05),其余各组差异均有统计学意义(其中Q72AD=13.4793,Q72BD=12.7546,均P＜0.05;Q72CD=7.3743,Q72Cr=8.3465,Q72AF=4.7455,Q72BF=3.9471,Q72DF=3.2649,均P＜0.01).不同浓度葡萄糖在不同时间点对RVEC凋亡率的影响:培养24h后各组间差异无统计学意义(P＞0.05).培养48h后,五组间两两比较,Q48AB=31.1704,Q48AC=33.5947,Q48BC=29.3968,Q48AD=30.4097,Q48BD=28.8164,均P＞0.05;Q48CF=12.5032,Q48AF=11.7531,Q48BF=14.1076,Q48DF=13.9372,均P＜0.05;Q48CF =7.0953,P＜0.01.培养72h后,五组间两两比较,Q72AB=26.3392,Q72AC=24.9142,Q72BC=30.2976,均P＞0.05,其余各组差异均有统计学意义(其中Q72AD=14.1983,Q72BD=12.9356,均P＜0.05;Q72CD=6.8752,Q72CF=7.6745,Q72AF=5.0545,Q72BF=4.0741,Q72DF=3.8876,均P＜0.01).结论:葡萄糖浓度为25mmol/L培养48h是RVEC高糖模型佳葡萄糖浓度及干预时间.
