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SCPP降解产物对血管内皮细胞迁移、增殖和F-肌动蛋白重组的影响
目的 研究骨组织工程支架材料掺锶聚磷酸钙(strontium-doped calcium polyphosphate, SCPP)的降解产物(degradation products, DPs)对血管形成密切相关的内皮细胞迁移、增殖和肌动蛋白微丝(F-actin)重组的影响,探索其对骨组织工程血管化的作用.方法 在聚磷酸钙(calcium polyphosphate, CPP)制备过程中掺锶制备SCPP多孔支架材料.生理盐水为降解介质,等离子体发射光谱检测降解液中DPs及浓度.用降解液处理脐静脉内皮细胞株ECV-304,噻唑蓝法和Millicell小室法分别检测细胞增殖和迁移.标记F-actin,荧光显微镜下观察.结果 与CPP和生理盐水组比较.结果 掺锶前后,孔隙率分别为(65±5)%和(64±5)%.SCPP各天降解液中Sr浓度为1.222～1.808 mg/L,约为CPP组的20～40倍,但Ca和P较低.SCPP组细胞增殖和迁移数显著高于CPP组和生理盐水,细胞中F-actin重组形成应力纤维数量明显增多.结论 SCPP的降解液能明显促进ECV-304的增殖.Sr是影响增殖的关键因素,SCPP降解液还能促进ECV-304的迁移,引起F-actin重组,形成与细胞迁移密切相关的应力纤维可能是促进迁移的原因之一.SCPP用作骨组织工程支架可能促进血管形成.
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巨噬细胞对掺锶聚磷酸钙降解行为影响的体外研究
目的 通过设计巨噬细胞在体外对SCPP的降解实验,为骨组织工程支架材料掺锶聚磷酸钙(SCPP)体内降解规律的研究提供基础和参考.方法 制备SCPP支架材料,将该材料与巨噬细胞RAW264.7培养6周以研究细胞介导的降解.用扫描电镜(SEM)观察细胞及材料形貌;复合电极测量培养液pH值变化和用等离子体发射光谱检测培养液中的Ca2+、磷(Pi)、Sr2+浓度.结果 SEM结果表明,培养细胞后材料孔径与粒径均减小,表面粗糙度增大,降解显著;细胞组培养液pH值在6.87～7.17之间,明显低于对照组;细胞组培养液中Ca2+、Pi、Sr2+释放量明显高于对照组.细胞介导的降解速率约为对照组的5倍,且Sr2+浓度在正常生理范围内.结论 在SCPP降解过程中,巨噬细胞加速了SCPP的降解,并在降解过程中起到主导作用.
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影响掺锶聚磷酸钙降解速率的工艺条件
目的:观察不同工艺条件下对掺锶聚磷酸钙降解速率的影响.方法:实验于2006-02/05在四川大学组织工程支架材料研究室完成.通过分别控制保温时间(3,5,7 h)制备3种不同聚合度的掺锶聚磷酸钙烧料,将烧料分别在700,800,900 ℃下煅烧得到不同工艺条件的掺锶聚磷酸钙材料样品,并在三羟甲基氨基甲烷-氯化氢溶液中进行45 d的降解实验.用31P核磁共振波谱仪检测其聚合度,扫描电镜观察其表面形貌变化,钼蓝比色法检测PO43-的质量浓度以表征其降解速率.结果:①31P核磁共振波谱表明,随着保温时间的延长,掺锶聚磷酸钙的聚合度逐渐增大,3种掺锶聚磷酸钙烧料的聚合度分别为9,13,19.②掺锶聚磷酸钙降解速率并不随聚合度增长而呈一单调变化的趋势.在相同的煅烧温度下,掺锶聚磷酸钙的降解速率由高到低分别为聚合度为13,9,19的掺锶聚磷酸钙.聚合度为13的掺锶聚磷酸钙降解液中PO43-的质量浓度达到0.44 g/L;相同保温时间下,掺锶聚磷酸钙的降解速率随煅烧温度的升高而增大.③扫描电镜显示,降解速率快的掺锶聚磷酸钙表面有CaP沉积物.结论:不同工艺条件下掺锶聚磷酸钙的降解速率不同,通过调节保温时间和煅烧温度可以在一定程度上调控掺锶聚磷酸钙的降解速率.
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掺锶聚磷酸钙对内皮细胞来源促血管化因子基质金属蛋白酶2表达的影响
背景:课题组研究的掺锶聚磷酸钙作为一种新型骨修复材料,具有良好的生物相容性和生物可降解性,经过前期的研究已证明有促血管化作用,但机制尚不清楚.目的:内皮细胞与掺锶聚磷酸钙支架于体外复合培养,观察细胞的增殖和促血管化因子基质金属蛋白酶2的分泌情况.设计、时间及地点:体外细胞学对比观察实验,于2008-09/2009-04在四川大学组织工程研究室完成.材料:在制备聚磷酸钙过程中掺入锶制备掺锶量为1%,2%,5%,8%,10%的掺锶聚磷酸钙骨组织工程支架材料.方法:①材料置于24孔培养板中,将浓度为3×10~7 L~(-1)的内皮细胞悬液300 μL接种于24孔培养板上,补加200 μL RPMI1640全培养液.分别于1,3,5,7 d通过MTT法观察内皮细胞的增殖情况.②聚磷酸钙和8%掺锶聚磷酸钙多孔支架放于24孔板中,将浓度为1×10~8L~(-1)的内皮细胞悬液300 μL接种于支架材料上,补加600 μL RPMI1640全培养液.培养5 d后取出材料,扫描电镜观察内皮细胞的形貌.③内皮细胞与不同掺锶量的掺锶聚磷酸钙支架材料复合培养5 d,至细胞汇合后,离心取上清液,采用酶联免疫吸附试验检测内皮细胞来源的基质金属蛋白酶2蛋白的分泌量.主要观察指标:观察掺锶聚磷酸钙和聚磷酸钙材料上内皮细胞的增殖及形貌,内皮细胞来源的基质金属蛋白酶2蛋白的分泌量.结果:MTT法实验结果表明,与聚磷酸钙组及其他掺锶量的掺锶聚磷酸钙比较,8%掺锶聚磷酸钙拥有更高的内皮细胞增殖度;扫描电镜表明在8%掺锶聚磷酸钙材料表面生长的内皮细胞具有更好的生长状态和生物活性;酶联免疫吸附试验法结果表明,与聚磷酸钙组相比,掺锶聚磷酸钙能上调基质金属蛋白酶2的蛋白分泌量,其中以8%掺锶聚磷酸钙为明显(P＜0.05).结论:掺锶聚磷酸钙与内皮细胞具有良好的生物相容性,明显上调促血管化因子基质金属蛋白酶2的分泌,具有促血管化的作用.
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掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响
目的:已有研究表明新型生物材料聚磷酸钙掺锶后能明显促进成骨细胞的增殖和分化.实验将掺锶聚磷酸钙与破骨细胞于体外复合培养,进一步从细胞的形态和生理功能两方面考察掺锶聚磷酸钙对破骨细胞的影响.方法:实验于2006-10/2007-01在四川大学组织工程支架材料研究室及四川大学华西医学院生物医学工程重点实验室完成.将机械分离法获得的新生兔长骨破骨细胞分别种植于1 cm×1 cm×80 μm的骨片及由"湿式法"溶液反应法制备的φ2 mm×10 mm的掺锶聚磷酸钙样品上,以聚磷酸钙为对照,复合培养于24孔培养板中.复合培养7 d后,采用特异性抗酒石酸酸性磷酸酶染色方法鉴定实验细胞,通过扫描电镜观察骨片和掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙材料表面破骨细胞的形貌及骨吸收陷窝的形成情况.实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求.结果:①抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示试验细胞呈阳性.②骨片上形成的骨吸收陷窝多呈不规则形状,陷窝边界清晰,底面粗糙.证实所培养的细胞为破骨细胞.③复合培养7 d后,掺锶聚磷酸钙组材料表面陷窝形成的数量明显少于聚磷酸钙组材料.④复合培养7 d后,掺锶聚磷酸钙组材料表面破骨细胞的增殖度明显低于聚磷酸钙组材料.结论:掺锶聚磷酸钙由于锶元素的掺入能通过降低破骨细胞的活性,阻碍破骨细胞的增殖分化,从而显著地抑制其骨吸收能力.
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掺锶聚磷酸钙对成骨细胞分泌血管内皮生长因子的影响
背景:掺锶聚磷酸钙作为一种新型骨修复材料,具有良好的生物相容性和可控降解性.课题组前期研究表明其具有促进血管牛成的作用,但其机制尚不清楚.目的:将ROS17/2.8成骨细胞与掺锶聚磷酸钙支架在体外共培养,观察细胞增殖情况和促血管生成因子血管内皮生长因子的分泌情况.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-10/2009-06在四川大学组织工程研究室完成.材料:制备掺锶量为1%,2%,5%,8%,10%的掺锶聚磷酸钙和未掺锶聚磷酸钙骨组织工程支架材料.ROS17/2.8成骨细胞株购自于四川大学华西医院移植免疫与移植工程实验室. 方法:①制备细胞支架复合物:将材料置于24孔培养板中,每孔接种300 μL细胞悬液(细胞浓度为2×10~7L~(-1)),培养14 d,隔天换液.②分别于1,3,5,7,10,14 d行MTT法观察成骨细胞的增殖情况.③将培养7 d的细胞支架复合物,离心取上清液,用夹心ELISA法检测血管内皮生长因子的分泌情况.主要观察指标:观察掺锶聚磷酸钙和未掺锶聚磷酸钙支架上成骨细胞的增殖情况及血管内皮生长因子的分泌情况.结果:MTT法实验结果表明,与未掺锶聚磷酸钙组相比,掺锶聚磷酸钙组能促进成骨细胞的增殖,且8%掺锶聚磷酸钙效果好;ELISA结果表明,与未掺锶聚磷酸钙组相比,掺锶聚磷酸钙组能上调血管内皮生长因子的蛋白分泌量,其中以8%掺锶聚磷酸钙促进作用为明显(P<0.05).结论:锶能有效促进成骨细胞增殖,并能明显上调血管内皮生长因子的分泌,且以8%掺锶聚磷酸钙效果好,在一定程度上揭示了其具有促血管化作用的机制.
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掺锶聚磷酸钙修复股骨头坏死骨缺损过程中VEGF表达的实验研究
[目的]探讨应用新型材料掺锶聚磷酸钙(strontium-doped calcium polyphosphate,SCPP)修复兔激素性股骨头坏死骨缺损过程中血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达及其意义.[方法]成年健康雄性日本大白兔21只,右侧臀肌注射甲泼尼龙20 mg/kg,每日1次,共3次,建立兔激素性股骨头坏死动物模型.2周时随机处死3只动物取材组织学证实造模成功后,其余18只,通过髋关节后外侧入路活门法(Trap-door)清除骨坏死组织.制成双侧股骨头直径2.5 mm×5 mm的圆柱形骨缺损,随机分为3组.A组植入掺锶聚磷酸钙;B组植入聚磷酸钙:C组植入自体松质骨.术后4、8、12周分批处死各组动物,通过影像学、组织病理学、VEGF免疫组织化学染色观察评价股骨头坏死骨缺损修复过程中VEGF的表达及其意义.[结果]各组均未出现关节脱位,关节间隙正常.A组成骨细胞和成纤维细胞VEGF免疫反应性高,骨缺损区完全修复,大部分材料被新生骨小梁替代,缺损区骨密度接近于周围骨组织;B组VEGF免疫反应性较A组低,骨缺损区大部分修复,新生骨小梁替代部分材料,骨小梁较A组纤细稀疏,缺损区骨密度低于周围骨组织.C组骨缺损区修复,与周围骨组织融合,自体松质骨周围大量胶原纤维包裹并有新骨生成.[结论]应用具有促进血管生成作用的掺锶聚磷酸钙修复兔激素性股骨头坏死骨缺损过程中,可通过诱导VEGF表达促进新生血管生成加速骨修复过程.
关键词： 血管内皮细胞生长因子 股骨头坏死 骨缺损 修复 掺锶聚磷酸钙 -
掺锶聚磷酸钙骨修复材料的制备及其对成骨细胞增殖的影响
目的：改进聚磷酸钙的力学特性和生物活性，为临床骨修复提供新材料。方法制备掺锶聚磷酸钙骨修复材料，采用万能材料试验机测试抗压强度，并采用噻唑蓝（MTT）比色法考察其对成骨细胞增殖的影响。结果掺锶聚磷酸钙多孔支架的抗压强度为（212.4±5.3）MPa，明显大于聚磷酸钙多孔支架的（172.5±8.3）MPa（ P<0.05）；掺锶聚磷酸钙多孔支架降解0，7，14，21 d时的抗压强度均大于聚磷酸钙多孔支架，差异均有统计学意义（ t=8.907，8.222，8.302，7.445，P<0.05）。MTT比色法结果表明，培养3，4，5 d后，掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙作用的成骨细胞的吸光度（ A）值高于阴性对照，差异均有统计学意义（ t=2.559，6.000，4.533，2.546，3.574，2.932，P<0.05）；培养4，5 d后，掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞的 A值高于聚磷酸钙，差异均有统计学意义（ t=2.733，2.038，P<0.05）。结论新型骨修复材料掺锶聚磷酸钙具有良好的抗压特性，并能促进成骨细胞的增殖，具有良好的临床应用前景。
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掺锶聚磷酸钙骨修复材料对成骨细胞血管内皮生长因子蛋白分泌量的影响
目的：探讨掺锶聚磷酸钙骨修复材料对成骨细胞血管内皮生长因子（VEGF）蛋白分泌量的影响。方法制备不同含锶量的掺锶聚磷酸钙骨修复材料，采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定成骨细胞的VEGF蛋白分泌量，并采用噻唑蓝( MTT )法考察其对成骨细胞增殖的影响。结果 ELISA法结果表明，培养7 d后，1%，3%，5%，8%，10%含锶量的掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞VEGF分泌量均高于聚磷酸钙，差异均有统计学意义( t=6.561，11.454，11.256，15.149，9.778，P﹤0.05)，其中，8%含锶量掺锶聚磷酸钙作用的成骨细胞VEGF分泌量高。MTT法结果表明，培养3，5，7，9 d后，8%掺锶聚磷酸钙、聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的吸光度（ A）值高于阴性对照，差异均有统计学意义( t=3.960，5.029，5.229，4.808，2.584，2.954，2.657，2.798，P﹤0.05)；培养5，7，9 d后，8%掺锶聚磷酸钙浸提液作用的成骨细胞的 A值高于聚磷酸钙，差异均有统计学意义( t=2.583，2.930，1.934，P﹤0.05)。结论掺锶聚磷酸钙作为一种新型的骨修复材料，能促进成骨细胞分泌VEGF，具有良好的临床应用前景。
