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成人牙周韧带干细胞分离培养及其定向分化的实验研究
干细胞(stem cell)是指具有高度增殖和自我更新能力,及多向分化潜能的细胞.在机体发育过程中,可存在处于不同分化等级的干细胞.我们对牙周韧带干细胞进行分离、培养,并进行脂肪化及矿化诱导,为进一步研究提供实验依据.
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新型重组人血小板衍化生长因子B腺病毒载体的构建与转染牙周干细胞的研究
目的 构建人血小板衍化生长因子B(platelet-derived growth factor-B,PDGF-B)重组复制缺陷型腺病毒载体,使其感染牙周韧带干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSC)并检测其相关生物学变化.方法 采用常规分子生物学方法,构建重组穿梭载体PAdTraekCMV-PDGF-B,用Pine I酶线性化后,线性化质粒在细菌BJ5183内与腺病毒骨架载体质粒AdEasy I同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-PDGF-B,在HEK293细胞中包装成重组腺病毒Ad-PDGF-B.Western blotting法检测其在HEK293中的表达情况,同时利用包装好的病毒感染PDLSC,用免疫组化的方法鉴定PDGF-B在细胞中的表达;采用甲基噻唑基四唑(MTr)法检测感染病毒后PDLSC的增殖变化,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染后细胞分泌I型胶原的变化.结果 重组缺陷型腺病毒载体经限制性内切酶酶切分析鉴定,与预期结果一致.重组质粒转染HEK293细胞3 d后即可观察到绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)明显表达,Western blotting检测证实PDGF-B表达.重组病毒能够感染PDLSC并表达蛋白,MTT结果显示感染Ad-PDGF-B后的PDLSC增殖能力明显加强.在感染后第4天,感染Ad-PDGF-B后的PDLSC组吸光度值为(0.68±0.02),与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).同时I型胶原表达量增高.结论 利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达EGFP和PDGF-B的重组复制缺陷型腺病毒Ad-PDGF-B,此病毒能够感染PDLSC并促进其增殖,同时增强I型胶原的表达,为牙周病患者牙周组织再生和种植体周韧带重建的基因治疗奠定基础.
关键词： 原癌基因蛋白质c-sis 腺病毒 人 转染 牙周韧带干细胞 -
2D培养条件牙周膜和牙髓干细胞肌腱或韧带基因表达水平的比较
目的 采用酶解组织块法培养牙周膜干细胞(PDLSCs)与牙髓干细胞(DPSCs),分别测定和比较这2种干细胞在2D培养下的肌腱/韧带相关基因(SCX、TNC、TNMD、Six1、Six2、Eya2等)的表达水平的差异.方法 运用酶解组织块法培养PDLSCs与DPSCs,通过克隆生长、流式细胞仪检测细胞周期、干细胞表型CD146、STRO-1鉴定、细胞免疫组化检测波形丝蛋白的表达等方式对其干细胞进行鉴定.测定和比较PDLSCs与DPSCs在2D培养情况下的肌腱相关基因标志表达水平的差异,分析PDLSCs与DPSCs在向肌腱组织分化的能力高低.结果 DPSCs与PDLSCs相比,表达的Eya2,TNC,Col-Ⅰ,Col-Ⅵ,TNMD基因的水平相近,而低表达SCX基因.结论 2D培养下,PDLSCs比DPSCs可能在向肌腱/韧带细胞转化方面更具优势.
