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趋化因子受体CCR5反义RNA重组腺病毒载体的构建
目的构建趋化因子受体CCR5反义核糖核酸(RNA)重组载体并获取重组腺病毒,用于抗艾滋病病毒1型(HIV-1)基因治疗研究.方法用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法,从健康人外周血单核细胞中扩增出趋化因子受体CCR5 5′端翻译起始区636bp的互补脱氧核糖核酸(cDNA)片段,将其克隆至Bluescript载体测序鉴定并确定方向之后,反向插入腺病毒载体穿梭载体pAdTrack-巨细胞病毒(CMV)中,再与骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183细菌同源重组,卡那霉素抗性培养基筛选阳性克隆;同源重组的载体用脂质体转染剂转染293细胞,在荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP),获取的重组腺病毒用PCR法鉴定、氯化铯密度梯度离心法纯化.结果成功构建了CCR5反义RNA重组腺病毒载体,并于293细胞中包装、扩增得到高滴度的重组腺病毒,其滴度为5×1011PFU/ml.结论成功地构建了携带CCR5反义RNA重组腺病毒载体,为研究其抗HIV-1的作用打下基础.
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选择性阻断异常Wnt信号通路对肝癌细胞生长及侵袭的影响
目的 构建T细胞转录因子(Tcf)反义RNA真核表达载体以阻断异常Wnt信号通路,探讨其对肝癌细胞生物学特性的影响.方法 利用GeneJammer将反义基因转染人肝癌细胞系SMMC-7721,应用RT-PCR及Western blot方法分别检测转染前后细胞mRNA及蛋白表达差异,通过生长曲线、Transwell小室实验比较转染细胞生长增殖及运动侵袭能力,并进一步用流式细胞仪检测细胞凋亡及生长周期的改变.结果 反义RNA转染降低了Tcf表达,减慢了肝癌细胞的生长速度并抑止其运动侵袭能力.转染反义RNA的肝癌细胞7721-pTas凋亡比例增加[(26.34±2.07)%],明显高于空载体转染细胞7721-vector[(6.53±1.02)%]和亲本SMMC-7721细胞[(4.33±0.68)%] (P<0.001).同时,处于G0-G1期的反义转染细胞比相应亲本SMMC-7721细胞和转染空载体的细胞7721-vector分别高20.24%和20.95%,而S期细胞比亲本细胞SMMC-7721和7721-vector细胞分别低11.8%和11.38%.结论 反义Tcf RNA转染可通过诱导细胞凋亡和阻止细胞周期的进程而抑制肝癌细胞的恶性增殖, 提示选择性阻断异常Wnt信号通路有望成为肝癌基因治疗的新途径.
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FasL反义RNA抑制人T淋巴细胞致凋亡作用的研究
目的:探讨反义RNA抑制活化T淋巴细胞FasL的表达及其对Fas阳性细胞的致凋亡作用,为FasL反义RNA的应用提供实验依据.方法:获得FasL反义RNA重组逆转录病毒,调整感染滴度后转染活化人外周血单个核细胞(HPBMC).采用流式细胞仪检测转染细胞表面FasL的表达以及对Fas+HL-60细胞的致凋亡能力.结果:空病毒载体的重复转染上调活化HPBMC FasL的表达,但转染重组病毒能有效抑制活化HPBMC表达FasL,表达率由13.93%下降至7.19%;FACS检测HL-60细胞的凋亡显示,转染重组病毒使活化HPBMC对HL-60细胞的致凋亡作用明显下降,凋亡率由33.48%降为17.28%.结论:FasL反义RNA能有效抑制活化淋巴细胞表达FasL及由其介导的凋亡作用,但究竟采用何种载体转录FasL的反义RNA有待研究.
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胆囊癌hTR反义RNA基因真核表达载体的构建
目的采用RT-PCR法,提取胆囊癌细胞内的端粒酶RNA(hTR)基因,并针对其序列设计反义RNA切割基因序列,并将其构建入真核表达载体pTriEx-4内.方法根据hTRcDNA序列,设计引物,经RT-PCR法从体外培养的胆囊癌细胞内调取hTR模板区基因,根据其测序结果,合成反义RNA基因,与经相应酶切的真核表达载体连接,酶切鉴定重组体的正确性.结果经RT-PCR从细胞内调出68bp序列,与hTRcDNA比较,与模板区域碱基序列一致.反义RNA基因重组子经酶切鉴定序列正确.结论RT-PCR法可调出胆囊癌hTR基因有效片段,成功构建了针对hTR模板区的反义RNA基因的真核表达载体,为胆囊癌的基因治疗奠定了良好的基础.
