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齐墩果酸通过MAPK/ERK信号传导通路对U87 MG细胞增殖及凋亡的体外实验研究
目的 探讨齐墩果酸(0A)对神经胶质母细胞瘤U87MG细胞增殖及细胞凋亡的影响.方法 以U87MG细胞为研究对象,使用25、50、80、100、150和200μg/ml的OA处理24、48和72h后,采用MTT实验检测OA对体外培养U87MG细胞增殖抑制作用,计算其抑制率；采用划痕法检测OA对U87MG细胞迁移能力的影响；用流式细胞仪分析OA对U87MG细胞周期与凋亡的影响；通过Western blot检测OA对MAPK/ERK信号传导通路活性的影响.结果 50μg/ml以上浓度的OA处理48h后,U87MG细胞的形态发生不同程度的变化,大量细胞脱落.150μg/ml和200μg/ml的OA处理U87MG细胞72h后,生长抑制率可达100％,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).25μg/ml的OA处理48 h后,迁移至划痕区的细胞数量相比于对照组明显减少.经50μg/mlOA作用48h后,处于Go/G1期的细胞从64.23％上升至75.03％,说明发生Go/G1期阻滞.同一浓度下,细胞凋亡率达到18.77％.U87MG细胞中MEK和ERK蛋白的磷酸化水平受到明显的抑制.结论 OA可显著抑制U87 MG细胞的生长增殖,呈一定的量效关系；OA可明显抑制U87MG细胞的迁移,并能抑制MAPK/ERK信号传导通路的激活.OA通过抑制MAPK/ERK信号传导通路的激活,可以抑制神经胶质母细胞瘤细胞的增殖生长.
关键词： 神经胶质母细胞瘤 齐墩果酸 MAPK/ERK信号通路 细胞凋亡 U87 MG细胞 -
双氢青蒿素对恶性胶质母细胞瘤细胞增殖与凋亡的影响
目的 探讨双氢青蒿素(DHA)对人恶性胶质母细胞瘤(U87)细胞增殖和凋亡的影响.方法将10,25,50,100,125 μmol·L-1DHA分别作用于体外常规培养的U87细胞24,48和72 h,CCK-8细胞增殖试剂盒实验检测细胞增殖情况并计算DHA不同作用时间半数抑制浓度(IC50);97.04 μmol·L-1DHA作用U87细胞24 h后倒置显微镜观察细胞形态变化,流式细胞分析细胞周期变化,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡,检测Caspase-3蛋白含量变化,双氢-乙酰乙酸二氯荧光黄(DCFH-DA)荧光探针检测活性氧(ROS)变化.结果 DHA浓度、作用时间不同,U87细胞存活率不同,差异有统计学意义(P＜0.05),DHA对U87细胞的抑制作用呈浓度和时间依赖性.DHA作用24 h时IC50为97.04 μmol·L-1,48 h为59.76 μmol·L-1,72 h为33.20 μmol·L-1;97.04 μmol·L-1DHA作用24 h后S期细胞减少,G0～G1期细胞增多,凋亡细胞增多,细胞内ROS增多.Caspase-3表达量较对照组高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DHA对U87增殖有抑制作用,可诱导细胞凋亡.其机制可能与DHA改变细胞周期,激活Caspase-3通路以及增加细胞内ROS有关.
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甲氨蝶呤通过RAS/MAPK/ERK/MYC/CD47信号通路抑制胶质母细胞瘤的生长
目的 研究MTX对RAS蛋白定位改变以及下游信号途径的影响,并探讨MTX抑制人胶质母细胞瘤细胞株U87生长的可能机制.方法 不同浓度的MTX(75nmol/L、375nmol/L、750nmol/L、7,500nmol/L、15,000nmol/L)处理U87细胞后,采用MTT法和FCM法分别检测细胞活力,细胞凋亡率及细胞周期.RAS-GFP和蛋白质印迹法分别检测RAS蛋白的分布定位和其下游MAPK/ERK蛋白的表达水平.采用逆转录病毒法将RAS-GFP融合基因转导至U87细胞,共聚焦显微镜技术能检测到RAS活化后定位分布,与不同的MAKP/ERK信号途径特异性抑制剂(U0126和PD98059)共培养,采用蛋白质印迹法检测MTX对P-P42/P44 MARK蛋白磷酸化水平的影响以及其调控转录因子c-MYC表达水平发的影响.50nmol/L的MTX处理U87细胞后,进一步用FCM法检测细胞表面分子CD47的表达水平.结果 不同浓度的MTX(75nmol/L、375nmol/L、750nmol/L、7,500nmol/L、15,000nmol/L)均能抑制人神经胶质母细胞瘤细胞株U87的增殖,呈剂量依赖性,不同浓度的MTX可将U87细胞阻滞于个G2/S期,并不能直接诱导细胞发生凋亡.转导RAS-GFP融合基因到U87细胞(100％ GFP),同对照组相比,用MTX处理后发现RAS蛋白从细胞膜转移到细胞质,从而通过降低或者抑制P-p42/p44MARK蛋白磷酸化水平(P＜0.05),以及抑制转录因子c-MYC的表达水平(P＜0.05),导致U87细胞生长受到抑制.我们还近一步证明了MTX抑制与神经胶质母细胞瘤生长密切相关的细胞表面分子CD47在不同时间的表达水平.结论 我们首次证明MTX通过改变RAS蛋白定位抑制MAPK/ERK/C-MYC信号导致神经胶质母细胞瘤U87细胞株的生长收到抑制,细胞停滞在G2/S期,提示MTX有可能作为复发胶质瘤患者可选的治疗药物.
