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脑胶质母细胞瘤干细胞球中标记滞留细胞表型研究
目的 对悬浮培养的脑胶质母细胞瘤干细胞球中的标记滞留细胞进行表型研究.方法 通过荧光标记滞留分析区分胶质母细胞瘤干细胞球中的标记滞留细胞及标记阴性细胞;通过体外克隆分析比较上述两类细胞的自我更新能力;以Western blot检测分化前后分化标记物的表达,评估其体外分化能力;给予放、化疗处理后检测细胞增殖,评估其放、化疗敏感性;通过免疫缺陷鼠颅内种植,评估其成瘤能力.结果 胶质瘤干细胞球细胞经初始DiI荧光标记示踪2周后,可区分慢增殖的DiI滞留细胞,其比例＜10％及快增殖的DiI阴性细胞.DiI滞留细胞经多次传代克隆分析,其克隆成球率保持恒定,而DiI阴性细胞呈显著下降(P＜0.05).DiI滞留细胞分化后分化标记物GFAP,PDGFRα以及βⅢ-tubulin蛋白表达相对于分化前显著上调(P＜0.05).给予10 Gy剂量照射或500μm/l替莫唑胺处理72 h后,DiI滞留细胞增殖相对于处理前无显著改变,而DiI阴性细胞增殖显著下降(P＜0.05).仅约100个DiI滞留细胞在长追踪观察6个月时在免疫缺陷鼠颅内已可成瘤,而相应数量的DiI阴性细胞未能成瘤.结论 胶质母细胞瘤干细胞球中呈现慢增殖特性的标记滞留细胞相对于标记阴性细富集了肿瘤干细胞.
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兔子宫内膜中标记滞留细胞的初步鉴定
目的:利用鉴定标记滞留细胞(LRC)的方法分析兔子宫内膜中可能存在的成体干细胞及其分布.方法:首先用促性腺激素处理兔,将子宫内膜调整到增殖期.并采用免疫组织化学方法鉴定增殖期子宫内膜中雌激素受体、孕激素受体、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,以评价子宫内膜的增殖期状态.BrdU标记后追踪8周,以鉴定LRC细胞的存在与分布.结果:增殖期子宫内膜较促性腺激素处理前明显增厚,子宫内膜中雌激素受体、孕激素受体与PCNA的表达明显升高.8周追踪后,子宫内膜中有(2.1±2.4)%的细胞核为BrdU阳性,即LRC细胞.这些LRC细胞主要存在于腔上皮组织中.结论:在成年兔子宫内膜中有LRC存在,子宫内膜成体干细胞可能存在于这些LRC中.
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免疫荧光双标法在小鼠表皮干细胞分子标记筛选中的应用
目的 用标记滞留细胞(LRCs)及免疫荧光双标记法进行小鼠表皮干细胞可靠分子标记的筛选.方法 选择出生5 d的昆明小乳鼠进行腹腔注射5-溴,2-脱氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine,BrdU),隔日注射,连续7 d.于注射后第90天进行取材,在冰冻切片上分别进行BrdU与整合素β1、P63和CD34的双重免疫荧光标记,观察这些标记物与BrdU的符合度.结果 90d后小鼠皮肤上皮细胞中仍有少数阳性细胞,主要存在于毛囊的隆突部位,另有少数阳性细胞散落在基底层.免疫荧光双标的结果 示,Brdu与整合素β1双标阳性的细胞占所有整合素β1阳性细胞的81%,占所有Brdu阳性细胞的94%;Brdu与P63双标阳性的细胞占所有P63阳性细胞的65%,占所有Brdu阳性细胞的86%;Brdu与CD34双标阳性的细胞占所有CD34阳性细胞的30%,占所有Brdu阳性细胞的62%.结论 整合素β1与BrdU的符合率高,P63其次.β1和P63是这些分子标记物中筛选干细胞好的指标.
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用BrdU标记滞留细胞联合Sox2表达检测晶状体干细胞
目的 检测小鼠晶状体上皮细胞中可能存在的晶状体干细胞及其分布位置.方法 60只(60眼)Balb/c小鼠随机分为BrdU标记组和生理盐水对照组,每组各30只(30眼).BrdU标记组以150mg· kg-1剂量的10g·L-1BrdU每天2次腹腔注射,连续注射10 d.生理盐水对照组以15 mL·kg-1生理盐水每天2次腹腔注射,连续注射10d.在BrdU或生理盐水注射结束后0周、1周、2周、3周、4周、6周、8周、10周、12和14周分别处死3只小鼠,制备眼球冰冻切片.通过免疫荧光化学染色观察晶状体上皮BrdU标记细胞的量和分布变化.在BrdU标记组,通过免疫荧光化学染色观察0周、4周、8周、12和14周晶状体上皮细胞Sox2蛋白的表达及分布规律.通过BrdU-Sox2双标记免疫荧光染色观察BrdU-Sox2双标阳性细胞.结果 BrdU标记组在完成BrdU标记时(0周),晶状体上皮中央区和赤道区BrdU标记率均达100％；随着时间延长,中央区和赤道区的BrdU标记率逐渐下降,至12周时降至低,中央区和赤道区分别为14.23％、5.86％ (P=0.000)；14周时中央区和赤道区分别为14.97％、6.11％(P=0.000),分别与12周时两区比较,差异均无统计学意义(均为p＞0.05).0周、4周、8周、12周和14周时,中央区Sox2阳性细胞率分别为3.74％、3.47％、4.23％、4.09％和3.70％,赤道区Sox2阳性细胞率分别为0.66％、0.37％、0.47％、0.33％和0.51％,各时间点中央区与赤道区Sox2阳性细胞率差异均无统计学意义(均为P＞0.05).Sox2在晶状体上皮细胞内表达稳定,主要分布于中央区.部分BrdU阳性细胞表达Sox2,即BrdU-Sox2双标阳性细胞,集中分布于晶状体上皮中央区.结论 表达Sox2的标记滞留细胞可能是晶状体干细胞,主要分布于晶状体上皮中央区.
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口腔黏膜中存在间充质干细胞的探索性实验研究
目的:确定口腔黏膜间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的存在及分布.方法:SD大鼠腹腔注射溴脱氧尿苷(BrdU),分别于注射后2、4、8周,免疫荧光法观察大鼠口腔黏膜中BrdU阳性细胞的存在及分布.结果:大鼠口腔黏膜内存在散在分布的BrdU阳性细胞,4周后阳性细胞比率趋于稳定.结论:SD大鼠口腔黏膜固有层存在间充质干细胞,该实验为进一步分离、鉴定以及研究MSCs在口腔黏膜病发病中的作用提供基础.
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溴脱氧尿苷标记滞留细胞在SD大鼠足垫皮肤及汗腺的分布
目的:将溴脱氧尿苷(BrdU)作为标记滞留细胞(LRCs)标记物,通过对皮肤组织中LRCs的检测,证实干细胞的存在及其分布.方法:SD大鼠予50 mg·kg-1·次-1BrdU腹腔注射,每天4次,每次间隔2h,连续2d.后一次注射后第6周,处死之,取双后足垫.免疫组化染色对表达BrdU细胞进行检测.结果:BrdU阳性细胞散在分布于真皮层的外泌汗腺蟠状分泌部、弯曲和直导管部.BrdU阳性细胞表达率在外泌汗腺((4.2±1.3)％)明显高于在表皮基底层((0.5±0.1)‰)(P＜0.05).结论:大鼠后足垫外泌汗腺中存在的这些干细胞或许在皮肤及其附件损伤修复中发挥重要作用.
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小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布规律
目的 通过标记滞留细胞技术检测昆明小鼠子宫内膜干细胞的存在及其分布规律.方法 取出生3 d雌性乳鼠皮下注射BrdU 50 μg/g体重,连续3 d.分别在注射后第1、2、3、4、6 和8周取子宫.采用免疫组化SP法检测子宫内膜BrdU的表达情况,并在高倍镜下计算阳性细胞百分率.结果 BrdU阳性细胞在第1周时在内膜上皮及基质部均广泛表达,但阳性细胞的数量随时间逐渐下降,至第8周时则主要位于基质部血管周围以及基质与肌层交界处.结论 小鼠子宫内膜基质中存在成体干细胞.
