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Notch信号通路体外介导肺癌细胞表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂获得性耐药的分子机制研究
目的 研究Notch信号通路在肺癌表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)吉非替尼获得性耐药中的作用机制.方法 选用EGFR 19号外显子缺失突变(DelE746-A750)的人肺癌PC9细胞株以及吉非替尼获得性耐药PC9/AB2细胞株.构建靶向Notch-1的siRNA真核表达载体,转染PC9/AB2细胞.DNA直接测序法检测EGFR基因20号外显子,荧光原位杂交试验(FISH)检测Met基因扩增.Western blot实验检测EGFR、Akt和Erk蛋白、Notch受体和配体、转化生长因子β(TGF-β)受体以及上皮间质标志物E-Cadherin、Vimentin和Snail表达水平.CCK-8法测定吉非替尼对PC9和PC9/AB2细胞的增殖抑制作用.结果 DNA直接测序法和FISH检测排除吉非替尼耐药株PC9/AB2存在T790M突变和MET扩增.Western blot检测显示PC9/AB2细胞中Notch-1表达较原代PC9细胞明显增强;其余Notch受体、配体和TGF-β受体无差异.PC9/AB2细胞上皮细胞性标志物E-Cadherin表达较PC9细胞明显下调,间质细胞性标志物Vimentin和Snail的表达较PC9明显上调.Notch-1 RNA干扰后PC9/AB2细胞Notch-1减弱,E-Cadherin表达上调,Vimentin和Snail表达明显下调.Notch-1RNA干扰后PC9/AB2细胞由细长梭形重新转变为类上皮细胞的鹅卵石形.RNA干扰下调Notch-1表达可部分逆转PC9/AB2细胞对吉非替尼耐药性、减弱锚定-不依赖性生长能力.结论 Notch-1活化在吉非替尼获得性耐药过程中起一定作用,抑制Notch-1表达可部分逆转吉非替尼获得性耐药.
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二氧化硅对人支气管上皮细胞发生上皮-间质转型的诱导作用
目的 探讨二氧化硅(SiO2)是否诱导人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)上皮-间质转型(epithelial-mesenchymal transition,EMT).方法 以200μg/ml SiO2诱导的HBE细胞为模型,倒置显微镜观察HBE细胞超微结构改变,免疫细胞化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)检测上皮细胞标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)和间质细胞标志物波形蛋白(Vimentin,Vim)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的改变.结果 200 μg/ml SiO2诱导HBE后,细胞呈梭形、纺锤形改变,间隙略微增宽.免疫细胞化学结果显示,200 μg/ml SiO2作用于HBE细胞,上皮细胞标志物E-cad表达下调,其平均染色强度积分(intensityscore,Is)由2.58±0.06减少为0.28±0.03,而间质细胞标志物Vim和α-SMA表达上调,Vim的Is值由0.14±0.01增加为1.99±0.03,α-SMA的Is值由0.14±0.02增加为1.64±0.06,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 SiO2可诱导HBE发生EMT.
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肺纤维化中上皮-间质转型信号转导机制研究进展
肺泡上皮细胞向间质细胞转型是纤维化局灶成纤维细胞的重要来源,各种刺激因子作用于细胞受体,诱导细胞通路改变,从而对上皮-间质转型进行调控.对肺纤维化中上皮-间质转型信号转导调控机制的研究,为发展新的治疗策略提供了重要信息.
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ERK信号通路调控二氧化硅诱导的人支气管上皮细胞上皮-间质转化
目的:探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路在二氧化硅( SiO2)诱导人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBEC)上皮-间质转型(epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用机制.方法:SiO2(0～ 300 μg/mL)处理HBEC 72 h,或不同浓度的U0126 (0 ～ 30μmol/L)干预1h后再行200 μg/mL SiO2刺激72 h,Western印迹检测E-cadherin和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的改变；使用丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活性检测试剂盒检测SiO2(200 μg/mL)处理HBEC(0～8 h)后ERK激活情况.结果:SiO2刺激HBEC后,E-cadherin蛋白表达水平逐渐下调,以300 μg/mL时为明显(P＜0.01),α-SMA蛋白表达水平逐渐上调,以200 μg/mL时为明显(P＜0.04).SiO2刺激HBEC后,ERK明显活化,ERK磷酸化水平于30 min开始升高,1h后逐渐降低.ERK抑制剂U0126明显抑制SiO2诱导的E-cadherin和α-SMA蛋白表达的变化,浓度为30 μmol/L时为明显(P＜0.01).结论:ERK信号通路参与调控SiO2诱导的HBEC的EMT.
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Twist对胃癌细胞系MKN28迁移和侵袭能力的影响
目的:研究Twist基因对人胃癌细胞株MKN28迁移和侵袭能力的影响.方法:利用脂质体介导转染技术和遗传霉素筛选得到稳定高表达的Twist蛋白的细胞克隆Twist+-MKN28;采用Western免疫印迹检测细胞中Twist,上皮细胞钙黏蛋白(ecadherin)和波形蛋白(vimentin)的表达;用基质胶侵袭小室检测细胞迁移和侵袭能力的影响.结果:阳性质粒组Twist+-MKN28细胞的Twist蛋白表达强于空白质粒组PcDNA3.1-MKN28和未转染组MKN28;Twist+-MKN28组细胞中ecadherin蛋白减少,而vimentin蛋白表达上调;Twist+-MKN28组细胞迁移、侵袭能力明显增强.结论:Twist基因可能通过上皮-间质转型促进胃癌细胞的迁移和侵袭.
