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透明质酸水凝胶包封对携带BMP-2基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞增殖活性及其表达的影响
目的:探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)基因的腺病毒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后应用透明质酸水凝胶(hyaluronic acid hydrogel,HAH)包封对BMSCs增殖能力及其表达目标蛋白BMP-2的影响.方法:体外分离、提取、鉴定BMSCs,并将提前构建好的Ad-BMP-2转染BMSCs并使用HAH进行包封,激光共聚焦显微镜下观察Ad-BMP-2转染的BMSCs在HAH包封下的三维形态.实验分为4组(各组培养条件无差异):A组(未转染BMP-2的BMSCs);B组(HAH+未转染BMP-2的BMSCs);C组(转染BMP-2的BMSCs);D组(HAH+转染BMP-2的BMSCs).分别一周内不同时相点(1d、2d、3 d……7d)使用CCK-8法检测各组OD值来评价细胞增殖活性;ELISA法检测各组BMP-2的量(pg/ml)来评价目标蛋白的表达状况.结果:激光共聚焦显微镜三维重建可观察到BMSCs可在HAH中任意平面铺展,有充足的生长空间.BMSCs的增殖活性检测显示,随着培养时间延长,细胞增殖活性逐渐增强,A组、C组4d后的OD值较1d时明显增大(P＜0.05);B组和D组5d后的OD值较1d时明显增大(P＜0.05);至7d时,A组OD值为1.283±0.061,B组为1.844±0.075;C组为1.570±0.099;D组为1.976±0.142,包封HAH的B、D组OD值均优于没有包封HAH的A、C组(P＜0.05).BMP-2的表达在A、B组较弱,不同时间点间无显著性差异(P＞0.05);C、D组的BMP-2表达各时间点均明显高于A、B组(P＜0.05);从4d时起,C、D两组的BMP-2表达显著增加(与1d时比较P＜0.05),且D组明显优于C组,差异有显著性(P＜0.05).结论:三维环境下(即包封HAH后),Ad-BMP-2转染的BMSCs不仅有较强的增殖活性;而且对BMP-2的表达具有一定的促进作用.
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透明质酸水凝胶体外促进骨髓间充质干细胞神经分化的研究
目的 观察以透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶作细胞支架,骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells,BMSCs)在HA水凝胶中的生长、增殖和分化情况,探讨HA水凝胶支持、促进BMSCs分化为神经元细胞的作用.方法 采用Percoll法从SD雄鼠的骨髓中分离纯化BMSCs,传代培养,倒置显微镜观察BMSCs的生长情况和形态变化.各组以不同的方法诱导BMSCs分化.采用免疫细胞化学法检测各组BMSCs在相应时间点神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)及巢蛋白(nestin)的阳性细胞数.RT-PCR检测各组BMSCs相应时间点的NSE mRNA、NF mRNA和nestin mRNA表达.结果 传代后BMSCs形似纤维细胞.诱导后,HA水凝胶组(A组)和脑组织提取液组(B组)BMSCs分化为神经元样细胞:A组细胞黏附在HA水凝胶表面,长出较多突起和分支fB组细胞出现突起及少量分支.诱导后A组和B组NSE、NF阳性细胞增多(P＜0.05).诱导2d后及7d后A组和B组nestin阳性细胞均增多:2d后,A组高于B组(P＜0.05)；7 d后,A组低于B组(P＜0.05).诱导7d后A组和B组的NSE mRNA、NF mRNA表达均增加,A组增加明显(P＜0.05).诱导2d后A组和B组的nestin mRNA表达增加,A组更显著(P＜0.05);7 d后A组和B组的nestin mRNA表达则降低,A组更明显(P＜0.05).结论 HA水凝胶有利于BMSCs的黏附,为BMSCs生长、增殖和分化提供了结构支持和适宜的微环境,促使BMSCs向神经元细胞分化、增殖并表达神经元特异性蛋白.
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缓释血管内皮生长因子的透明质酸水凝胶对大鼠脑损伤的修复作用
目的:探讨缓释血管内皮生长因子(VEGF)的透明质酸(HA)水凝胶对脑损伤大鼠的修复效果.方法:制备HA水凝胶并在其中添加包封VEGF的聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球,形成可缓释VEGF的HA水凝胶复合支架.选用成年SD大鼠制备脑损伤模型,随机分为3组:将HA复合支架植入大鼠脑损伤区作为实验组(HA+ PLGA组);单纯模型组;不添加PLGA微球的HA水凝胶植入作为HA对照组(HA组).结果:HA水凝胶复合支架呈疏松多孔网状结构,可缓慢释放VEGF至少2周;术后8周大体观察可见HA水凝胶和脑组织整合良好,表面光滑;Nissl染色显示支架材料内有大量神经细胞;免疫荧光染色显示单纯HA支架可减轻脑损伤区胶质瘢痕的形成,缓释VEGF的HA复合支架对胶质瘢痕有更强的抑制作用;半薄切片组织学染色可见复合支架植入区有大量新生的血管,有大量细胞,血管周围可见神经纤维,而在单纯HA移植区血管和细胞较少.结论:缓释VEGF的HA水凝胶可与脑组织较好的整合,抑制胶质瘢痕的形成,诱导血管再生,进而促进大鼠脑损伤后的组织修复.
