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动态观察胱天蛋白酶募集域蛋白9在心肌梗死后表达的基础研究
目的:探讨心肌梗死后小鼠胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9,CARD9)的表达及其与炎症的关系.方法:选择野生型小鼠和CARD9敲除小鼠各26只,分为野生型对照组、野生型心肌梗死组、CARD9敲除对照组和CARD9敲除心肌梗死组共4组,每组13只.心肌梗死模型组是通过结扎冠状动脉前降支复制心肌梗死模型,而对照组仅穿线不结扎.于模型复制后第1天,从每组随机抽取3只小鼠处死并行氯化三苯四氮唑(TTC)染色,观察模型是否复制成功；于第3天和第28天,每组分别随机各抽取3只小鼠,处死后取心肌组织行石蜡切片,苏木素伊红(HE)染色和免疫组化染色观察炎症细胞浸润,免疫组化染色和蛋白定量观察CARD9表达.结果:TTC证实心肌梗死模型复制成功；免疫组化染色和蛋白印迹证实,与野生型对照组比较,野生型心肌梗死组3d及28d时梗死区域CARD9表达均增高(P＜0.05)与野生型心肌梗死组比较,3d时CARD9敲除组心肌梗死组巨噬细胞浸润增加(P＜0.05).结论:心肌梗死后CARD9表达上调,而CARD9敲除炎症细胞浸润增加,提示CARD9参与心肌梗死并对早期炎症可能有一定抑制作用.
关键词： 心肌梗死 炎症 胱天蛋白酶募集域蛋白9 -
CARD9突变在真菌感染性疾病中的研究进展
胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containg protein 9,CARD9)属于CARD家族中的一员,存在于脾、肝、胎盘、肺、脑等人体多种组织中,是高度表达于中性粒细胞、巨噬细胞及树突细胞等髓系细胞中的一个重要衔接蛋白.CARD9可与Bcl-10、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤转运蛋白1(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma translocation protein 1,MALT-1)结合并形成CARD9-Bcl-10-MALT-1(CBM)复合体,作为C型凝集素受体(C-type lectin receptor,CLR)等通路的重要媒介,激活核因子 κB(nuclear factorκB,NF-κB)等炎症信号通路,在抗真菌免疫中发挥重要作用.迄今为止,全世界已报道14个国家共56例患者发生18种CARD9突变的报道,真菌类型涉及念珠菌、皮肤癣菌、暗色真菌及曲霉等.本文针对CA R D9突变在不同真菌感染性疾病中的研究进展进行综述.
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抑制腹腔巨噬细胞胱天蛋白酶募集域蛋白9对大鼠重症急性胰腺炎炎性反应的影响
目的 研究腹腔巨噬细胞中的胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)表达对大鼠重症急性胰腺炎(SAP)的影响及其作用机制.方法 将60只雄性Sprague Dawley大鼠分成对照组(6只)、SAP组(18只)、小干扰对照组(18只)和小干扰CARD9组(18只).建立SAP大鼠模型,造模后3、6、12 h收集腹水并行腹腔灌洗,分离、培养腹腔巨噬细胞.采用实时荧光定量 PCR法检测腹腔巨噬细胞中CARD9、NF-κB、p38MA PK的mRNA水平.采用 ELISA 法检测大鼠外周血中 TNF-α、IL-1β、IL-6的水平.统计学分析采用LSD检验或Tamhane's T2法.结果 造模后3、6、12 h,SAP组大鼠腹腔巨噬细胞中的 CA RD9 mRNA水平分别为1.63 ± 0.05、1.68 ± 0.24、2.61 ± 0.02,均高于对照组的1.01 ± 0.23,差异均有统计学意义(t=25.97、6.86、131.59,P均<0.05);小干扰CARD9组的 CA RD9 mRNA水平分别为1.45 ± 0.02、1.24 ± 0.03、1.63 ± 0.03,分别低于SAP组同一时间点的水平,差异均有统计学意义(t= -7.81、-4.46、-62.13,P均<0.05).造模后3、6、12 h,SAP组大鼠腹腔巨噬细胞中 N F-κB和p38MA PK的mRNA水平分别为1.51 ± 0.08、1.81 ± 0.10、2.30 ± 0.05和1.37 ± 0.13、1.69 ± 0.18、2.42 ± 0.23,分别高于对照组的1.00 ± 0.01和1.03 ± 0.08,差异均有统计学意义(tNF-κB=15.10、19.95、60.36,tp38MAPK=5.37、8.34、14.11;P均<0.05);小干扰CARD9组 NF-κB mRNA水平分别为1.38 ± 0.05、1.57 ± 0.06、1.76 ± 0.09,分别低于SAP组同一时间点的水平,差异均有统计学意义(t= -3.32、-5.07、-12.70,P均<0.05);造模后6和12 h,小干扰CARD9组 p38MA PK mRNA水平分别为1.50 ± 0.10、2.00 ± 0.09,分别低于SAP组,差异均有统计学意义(t= -2.30、-4.17,P均<0.05).造模后3、6、12 h,SAP组外周血中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平分别为(53.49 ± 21.64)、(108.62 ± 22.76)、(139.00 ± 15.35)pg/mL,(43.86 ± 18.30)、(87.51 ± 17.10)、(117.27 ± 14.57)pg/mL,(78.38 ± 32.70)、(156.39 ± 30.56)、(209.56 ± 26.09)pg/mL,分别高于对照组的(2.79 ± 1.17)、(7.13 ± 4.52)、(12.73 ± 8.08)pg/mL,差异均有统计学意义(tTNF-α=5.73、11.37、21.69,tIL-1β=4.77、11.13、17.68,tIL-6=4.77、11.32、17.68;P均<0.05);造模后6和12 h,小干扰CARD9组 TNF-α、IL-1β和IL-6水平分别为(75.73 ± 16.93)、(108.23 ± 14.02)pg/mL,(63.05 ± 11.98)、(91.56 ± 14.28)pg/mL,(112.67 ± 21.40)、(163.62 ± 25.51)pg/mL,分别低于SAP组,差异均有统计学意义(tTNF-α= -2.84、-3.63,tIL-1β= -2.88、-3.09, tIL-6= -2.88、-3.09;P均< 0.05).结论 SAP 大鼠腹腔巨噬细胞存在 CARD9相关的 NF-κB、p38MAPK信号通路,干扰腹腔巨噬细胞中CARD9的表达,在SAP早期阶段进行干预,能减轻炎性反应和胰腺损伤,为SAP的治疗提供新思路.
关键词： 巨噬细胞 腹腔 NF-κB p38丝裂原活化蛋白激酶类 RNA 小分子干扰 大鼠 胰腺炎 重症急性 胱天蛋白酶募集域蛋白9 -
胱天蛋白酶募集域蛋白9-麦芽糖结合蛋白融合蛋白的原核表达及纯化
目的 胱天蛋白酶募集域蛋白9(CARD9)可激活核因子-κB(NF-κB)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)等通路参与免疫,但其作用机制至今尚未阐明.为进行相关体外实验,构建CARD9-麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的原核表达载体,并对融合蛋白进行表达鉴定及纯化.方法 利用PCR技术分别扩增CARD9和MBP基因的编码序列,将两者正确插入pET-30a(+)载体中得到重组质粒,后转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中,并进行PCR和酶切鉴定以及基因测序.将正确的重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,筛选不同条件进行IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白质的相对分子质量.通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱对CARD9-MBP融合蛋白进行纯化,用HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后进行MALDI-TOF质谱鉴定.结果 成功构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,PCR和酶切鉴定为阳性且基因测序结果与目的序列一致.SDS-PAGE电泳显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量约为105000的目的蛋白.通过MBP麦芽糖层析柱的初步纯化后,可得到相对较纯的融合目的蛋白,经HRV3C蛋白酶酶切去除MBP标签后行MALDI-TOF质谱鉴定其确为CARD9蛋白.后期通过分子筛层析柱进一步纯化得到了更纯的CARD9-MBP融合蛋白.结论 成功构建了重组CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体,并进行了大量可溶性表达.通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱的纯化,可得到较纯的目的蛋白.
关键词： 胱天蛋白酶募集域蛋白9 原核表达 MBP麦芽糖层析柱 分子筛层析 -
CARD9在炎症信号通路中的作用研究进展
胱天蛋白酶募集域蛋白9（ CARD9）是 Bertin等［1］在对CARD研究时发现的一个重要衔接蛋白，通过蛋白间的相互作用调节细胞内信号传导。 CARD9定位于染色体9q34．3，CARD9cDNA全长2108 bp，编码536个氨基酸残基，产生相对分子质量为62．3 kD的蛋白质。 CARD9包含一个具有胱天蛋白酶募集功能的N末端区域和一个具有寡聚化作用的卷曲螺旋C末端区，通过CARD-CARD相互作用与B细胞淋巴瘤10（Bcl 10）相连，而Bcl 10直接与黏膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白1（ MALT 1）连接激活细胞。在炎症反应中，CARD9与Bcl 10和MALT 1形成CBM复合体，连接模式识别受体（ PRRs ）。 CARD9能够识别细菌、真菌和病毒，也能够识别内源性危险信号。在宿主的防护方面， CARD9在炎症信号传导过程中发挥重要作用， CARD9的多态性与人类的炎症性疾病也有着紧密关系。现将CARD9在炎症信号通路中的作用研究进展综述如下。
关键词： 胱天蛋白酶募集域蛋白9 信号调节 宿主防御 基因多态性
