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Ag85A DNA疫苗加强免疫显著提高卡介苗初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答
目的 构建表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗,分析其加强免疫后提高卡介苗(BCG)初免小鼠的抗结核T细胞免疫应答.方法 以Mtb毒株H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增Ag85A抗原编码的结构基因并克隆至真核表达载体pVAX1中构建其DNA疫苗；接着,将纯化后的该DNA疫苗加强免疫BCG初免小鼠2针,以BCG和DNA单独免疫小鼠为对照,免疫8周后无菌分离脾淋巴细胞,分别应用IFN-γ ELISPOT和多因子胞内流式细胞术(intracellular staining)分析免疫小鼠的Mtb抗原特异性效应细胞免疫水平与分泌IFN-γ/TNF-α/IL-2的多功能CD4+T细胞频率及其强度以及CD8+T细胞免疫应答.结果 与BCG免疫及DNA单独免疫组相比,Ag85A DNA加强免疫不仅能显著提高小鼠IFN-γ+TNF-α+IL-2+多功能T细胞,IFN-γ+IL-2+、IL-2+TNF-α+双功能T细胞与IL-2+单功能T细胞的频率以及IL-2的分泌能力,还能显著诱导小鼠产生更多分泌IFN-γ和IL-2的CD8+T细胞.结论 本研究成功构建了表达Mtb免疫优势抗原Ag85A的DNA疫苗并分析了其免疫原性,证实了BCG初免-DNA加强的免疫策略可同时显著增强实验小鼠的Mtb抗原特异性CD4+T和CD8+T细胞应答水平,有利于提高BCG的免疫原性,为增强BCG逐渐下降的抗结核保护效果提供新思路.
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抗结核治疗中特异性T细胞免疫反应动态分析及其临床意义
目前,抗结核的化疗方案包括2个月的强化期与4个月的巩固期,而治疗过程中特异性细胞免疫应答随细菌载量改变呈现的动态变化特征有可能成为治疗疗效的生物标志物,并为个性化治疗方案提供理论依据.为此,我们收集了9例活动性结核病患者治疗前,治疗2、4、6个月的外周血样本,采用酶联免疫斑点测定法(enzyme-linked immune spot assay,ELISPOT)测定了不同治疗阶段结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10刺激下PBMC中分泌IFN-γ的细胞数量,同时分析了抗原特异性Th1型细胞因子分泌水平以及多功能T细胞比例的动态变化特征.结果显示:随着治疗的深入,ESAT-6及CFP-10刺激患者PBMC后,释放IFN-γ的细胞数量显著下降(P＜0.05).CD4+ IFN-γ+T淋巴细胞的比例在治疗前与治疗6个月时相比有下降趋势,且治疗后结果具有归一性;虽然多功能T细胞有重要抗结核作用,但在我们统计的患者治疗过程中的变化不明显.以上结果表明抗结核治疗过程中外周淋巴细胞抗原特异性释放IFN-γ的细胞数量与CD4+ IFN-γ+T淋巴细胞的比例随着患者的病情好转呈现下降趋势,提示抗原特异性细胞免疫应答的动态变化谱与病原菌负荷下降存在密切关系,可能成为抗结核治疗过程中的免疫学标志物.
