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测定病毒感染性的PMA-核酸检测法的研究进展
大量的分析方法可用于检测临床样品中的病毒,例如动物感染试验、细胞培养试验和聚合酶链式反应.核酸检测法有很高的敏感性和特异性,但是未能建立被检病毒基因组和病毒感染性间的关系.叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)-核酸检测法可弥补此缺陷,从而测定病毒的感染性.本综述描述了PMA-核酸检测法的原理和步骤,分析了PMA-核酸检测法的优势和局限,讨论了病毒结构、灭活方式和实验条件对PMA-核酸检测法的影响,并总结了该方法的研究进展.
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应用PMA-qPCR方法快速准确检测发酵乳制品中副干酪乳杆菌活菌的研究
目的 建立快速、准确检测发酵乳制品中副干酪乳杆菌活菌的方法.方法 发酵乳制品中副干酪乳杆菌先经PMA处理后,采用沸水浴的方法提取副干酪乳杆菌基因组,然后通过qPCR方法检测发酵乳制品中的活菌.结果 副干酪乳杆菌经90℃处理6 min,即为膜损伤菌:PMA能够抑制107 CFU/mL死菌DNA的扩增,而不影响活菌DNA的扩增；PMA-qPCR能够准确检测到样品中活菌.结论 建立了一种快速、准确的方法检测发酵乳制品中的副干酪乳杆菌活菌.
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氮溴化丙锭与聚合酶链反应结合的细菌活细胞检测方法
目的:区分细菌PCR 过程中的死活菌.方法:使用叠氮溴化丙锭(PMA )处理提取样品的基因,使样品中死细胞的DNA 分子与PMA 发生共价交联,使其DNA 分子的PCR 扩增被抑制.结果:当浊度＜10 NTU 时,对死细胞DNA 的PCR 扩增,PMA 具备的抑制效用仍然有效;当浊度＞100 NTU 时,PMA 的抑制效果就会失去.而当样品中的PMA 质量浓度＞3 μg/ml 时,曝光时间就会超过3 min,PMA 可对死细胞DNA 的PCR 扩增进行抑制;PMA 质量浓度＞50 μg/ml 时,活细胞DNA 的PCR 扩增就会受到影响.结论:对异丙醇处理、热处理引起的细菌细胞膜破裂而产生的死细胞,可通过PMA 与PCR 结合的方法进行选择性地检测,能较好的区分死活菌.
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实时荧光定量PCR方法应用于药品无菌快速检测的研究
目的 建立应用实时荧光定量PCR进行无菌快速检测的方法.方法 选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,用裂解试剂盒抽提细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR检测,并应用叠氮溴化丙锭(PMA)抑制样品中死菌基因组DNA的PCR扩增.结果 PMA能有效去除样品中死菌干扰,针对16S rRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度.在金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌检测中,低含菌量组与阴性对照组Ct值有明显差异(P＜0.05),其低检出限为2 CFU/PCR.在对人工污染药品的无菌检测中,该方法与药典检测方法结果一致.结论 进行无菌检查时,采用PMA去除样品中死菌基因组DNA干扰,以裂解试剂盒抽提细菌基因组后用荧光定量PCR分析样品中细菌污染,可将检测时间缩短到4h左右,操作简单,灵敏性高,可应用于药品无菌检查的快速筛查.
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纳米银对多菌种生物膜中粪肠球菌的杀菌作用
目的:研究纳米银对多菌种生物膜中粪肠球菌的杀菌作用.方法:用粪肠球菌、产黑色素普雷沃菌以及具核梭杆菌构建多菌种生物膜85 个.分别用0.1%(12~15 nm、100 nm)纳米银悬浊液以及2%的次氯酸钠溶液处理,然后通过qPCR方法检测样本中粪肠球菌的活菌量和粪肠球菌的细菌总量.配对t检验比较各组细菌样本临界循环数(Ct).结果:各个实验组使用和不使用PMA之间粪肠球菌的细菌计数有着差别(P=0.000);将3 个实验组使用和不使用PMA qPCR检测到的Ct值的差值进行比较:纳米银(12~15 nm)实验组大,纳米银(100 nm)实验组次之,次氯酸钠实验组小(P<0.05).结论:纳米银对于多菌种生物膜中的粪肠球菌有着较强的杀菌作用,直径较小的纳米银杀菌作用较强.
关键词： 纳米银 叠氮溴化丙锭 实时PCR 多菌种生物膜 粪肠球菌(E.faecalis)
