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HCV核心蛋白结合蛋白基因6的克隆
目的克隆与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因. 方法应用酵母双杂交系统,构建丙型肝炎病毒核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.筛选出30个克隆,既能在四缺营养缺陷培养基上生长(SD/-Trp-Leu-Ade-His)又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒,转化大肠埃希菌后进行测序,进行生物信息学分析.结果分析结果显示,其中6号克隆的测序结果与Genbank中的2个未知功能序列有98%的同源性,初步证明了此基因与丙型肝炎病毒核心蛋白有结合性.结论丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白肝基因克隆成功.
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HCV核心蛋白与HBV X蛋白协同反式激活作用的研究
目的探讨HCV核心蛋白与HBV X蛋白的协同反式激活作用.方法构建表达HCV核心蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)core和表达HBV X蛋白的重组质粒pcDNA3.1(-)X;转染HepG2细胞,从转录和翻译水平鉴定病毒基因的瞬时表达;与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞,检测β-半乳糖苷酶表达活性,酶的活性反映了表达的肝炎病毒蛋白对SV40病毒早期启动子/增强子功能的影响.结果构建成HCV核心蛋白及HBV X蛋白的重组表达载体pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X;在HepG2细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白;单独共转染试验中pcDNA3.1(-)core、pcDNA3.1(-)X组的β-半乳糖苷酶的表达分别是对照的4.9、3.5倍,两种质粒共同转染时酶的表达是对照的9倍;表达质粒对β-半乳糖苷酶表达的激活作用呈剂量依赖性.结论 HepG2细胞中表达的HCV核心蛋白和HBV X蛋白均具有反式激活SV40早期启动子/增强子的功能,并且两种蛋白的反式激活功能具有协同特性.本试验有助于解释HCV、HBV感染,尤其是共同感染的致病/癌机制.
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丙型肝炎病毒核心蛋白在胆管癌组织上皮间叶样表型转化中的作用
目的 探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc蛋白)在胆管癌组织浸润和转移中的作用.方法 随机选取2001年1月至2006年11月间有完整随访资料的34例行根治性切除术的胆管癌患者.采用免疫组织化学方法检测胆管癌组织标本中HCVc蛋白、上皮性标志物及间叶性标志物的表达情况,并与临床病理学指标进行比较分析.结果 34例胆管癌组织中HCVc蛋白的阳性表达率是47.1%,上皮性标志物的缺失率分别为上皮性钙黏附素(E-cadherin)55.9%、α连环蛋白(α-catenin)70.6%、β连环蛋白(β-catenin)55.9%,间叶性标志物的阳性表达率分别为神经性钙黏附素(Ncadherin)50%、波形蛋白(Vimentin)44.1%、纤维连接蛋白(Fibronectin)55.9%,HCVc蛋白的阳性表达与E-cadherin、α-catenin的缺失以及N-cadherin、Vimentin、Fibronectin的阳性表达相关(x2=4.480、4.163、4.250、7.438、12.260,P值均＜0.05),并与胆管癌组织的淋巴结转移及其他脏器转移相关(x2=5.708、4.163,P值均＜0.05).结论 HCVc蛋白可能通过诱导胆管癌组织上皮-间叶样表型转化的发生来促进胆管癌的浸润和转移.
关键词： 胆管癌 病毒核心蛋白类 上皮-间叶样表型转化 浸润 转移 -
癌周及癌中心不同截短片段丙型肝炎病毒核心蛋白表达质粒的构建及表达
目的研究不同截短片段丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白(CORE)在HCV持续感染和肝癌发病机制中的作用,构建并表达不同HCV病毒株及不同截短片断CORE原核表达质粒.方法用PCR扩增基因型为HCV 1b型的7个不同截短片段CORE基因:氨基酸(aa)长度分别为癌中心株(BT):B:1-172 aa、1-126 aa、1-58 aa、59-126 aa、127-172 aa;癌旁株(BNT):1-172 aa及C191(HCV-J6):1-172 a a,扩增产物用BamH Ⅰ及EcoR Ⅰ双酶切后将其插入到原核表达质粒pGEX-4T-1中,阳性克隆转染到BL21中,IPTG诱导表达GST-CORE融合蛋白,纯化定量,并用western blot加以验证.结果7个不同片段CORE在体外都得到相应表达,但表达量存在一定的差异,较长片段表达量相对较低,其中BT及BNT的1-172 aa截短片段CORE的表达高于同基因型等长度片段的C191,而BT以59-126 aa片段的表达量高.BT、BNT及C191三株HCV基因1b型病毒株部分截短片段可形成二聚体.结论构建不同HCV病毒株及不同截短片段的COR E原核表达质粒获得成功,为研究HCV不同病毒株及不同区域CORE功能奠定基础;不同截短片段的CORE表达量不等,可能与不同片段具有不同的疏水基团、细胞毒性及在HCV结构和在HCV致病性中所起作用不同有关;HCV基因1b型的CORE二聚体的形成依耐于59-126 aa区域.
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丙型肝炎病毒核心蛋白致癌作用的研究
研究表明丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白可能具有潜在的直接致癌作用.应用腺相关病毒载体介导的病毒重组技术,成功观察到HCV核心蛋白诱发的肝癌形成.
