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使用RNAi技术抑制HeLa细胞p42MAPK表达
目的筛选可抑制HeLa细胞p42MAPK表达的siRNA.方法采用体外转录合成的方法,合成针对p42MAPK的siRNA 3条和阴性对照siRNA 1条,并进行Cy-3荧光标记,用脂质体转染HeLa细胞,以判断转染效果.应用噻唑蓝(MTF)法和流式细胞仪检测siRNA的作用效果,筛选具有功能的siRNA序列;应用Western blot方法鉴定siRNA抑制p42MAPK表达的效果.结果从3条p42MAPKsiRNA中筛选出2条有效的序列siRNA-2和siRNA-3,与空白对照组、脂质体对照组和随机siRNA-4相比,两者均可诱导HeLa细胞p42MAPK表达下调,Western blot结果分析显示,与随机siRNA-4相比分别下调了1/2和2/3,并抑制HeLa细胞的增殖(P＜0.05),同时改变了细胞周期各时相的细胞分布.结论p42MAPK siRNA-2和siRNA-3在体外实验中可沉默目的基因以及抑制HeLa细胞增殖.
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肝脏缺血预处理细胞保护效应中蛋白激酶C对P44/42丝裂原激活蛋白激酶和热休克蛋白70的调控作用
目的研究蛋白激酶C(PKC)、P44/42丝裂原激活蛋白激酶(P44/42 mitogen-activated protein kinase, P44/42MAPKs)、热休克蛋白70(HSP70)信号通路在肝脏缺血预处理细胞保护效应中的作用.方法建立大鼠肝脏缺血预处理模型,应用PKC抑制剂、激动剂和丝裂原激活的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)抑制剂,通过检测PKC和P44/42MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量、血清天氡氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶的活性变化,同时观察光镜和电镜下细胞形态学损害.对相关数据进行统计学处理.结果与缺血再灌注组比较,预处理组和PKC激动剂组的PKC磷酸化水平显著增高(P<0.01), P44/42 MAPKs磷酸化水平、HSP70表达量明显增加,肝细胞结构改变较小.与缺血预处理组相比,PKC抑制剂组相应的观察指标呈相反变化,PKC磷酸化水平显著降低(P<0.01);MEK抑制剂组的P44/42 MAPKs磷酸化激活显著减少,HSP70表达量降低,肝组织细胞结构出现较明显的改变.结论体内缺血预处理保护作用中,PKC激活对P44/42 MAPKs通路激活起到至关重要的作用,PKC对P44/42 MAPKs起正性调控作用, HSP70表达受P44/42 MAPKs调控.
