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基于人CD105分子的酵母展示系统的构建
目的：构建基于人 CD105分子的酵母表面展示系统。方法以人 CD105 cDNA为模板，扩增 CD105基因片段，转化到酵母表面展示载体 pYDs，构建 pYDs-CD105重组质粒；将重组质粒转化酵母细胞，测序鉴定，并通过流式细胞仪分析 CD105的表达。结果测序表明 CD105基因片段转入 pYDs质粒，流式细胞仪检测到酵母细胞表面有 CD105分子的表达。结论成功构建了基于人 CD105分子的酵母表面展示系统，为本实验室获得 CD105单克隆抗体杂交瘤细胞株提供了新的筛选平台。
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酵母表面展示多肽片段分析Δ42 PD1的免疫原性
目的：分析Δ42PD1胞外区的免疫原性。方法：将Δ42PD1胞外区编码基因分为6个片段，分别用PCR的方法进行扩增，并克隆至酵母表面展示质粒pCTCON2。分别将重组酵母表达质粒转化酵母细胞，涂布SDCAA平板，挑取单细胞克隆于SGCAA培养基中诱导目的基因的表达。通过肌肉注射Δ42PD1真核表达质粒加局部电穿孔的方法免疫BALB／c小鼠，制备鼠抗人Δ42PD1免疫血清。用流式细胞术的方法分析免疫血清与酵母表面展示的Δ42PD1多肽片段的结合。结果：PCR扩增的Δ42PD1的6个片段的编码序列全长均110 bp，核酸序列分析显示克隆的目的基因与GenBank中已经登记的PD1基因序列100％同源；流式细胞术的结果发现酵母表面展示的Δ42PD1的F3和F2片段可与Δ42PD1的免疫血清发生明显结合。结论：Δ42PD1的F3和F2片段是该分子的免疫优势区域，为制备Δ42PD1的单克隆抗体及表位筛选奠定了基础。
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人杀菌通透性增强蛋白功能性N端片段在酵母细胞表面的展示和鉴定
目的:建立BPI23酵母细胞表面展示方法,使之表达具有生物活性的BPI23蛋白.方法:构建pYD1-BPI600重组质粒,转化酵母细胞,经半乳糖诱导使BPI23在酵母细胞表面表达;采用间接免疫荧光法,用荧光显微镜和流式细胞仪检测BPI23在酵母细胞表面的展示情况;采用鲎基质显色法,检测BPI23 中和内毒素的生物学活性.结果:酶切和DNA测序鉴定证实,pYD1-BPI600重组质粒含有人BPI600基因片段.荧光显微镜和流式细胞仪检测结果显示,BPI23在pYD1-BPI600重组质粒转化的酵母细胞表面得到展示;在诱导后第24小时展示BPI23的酵母细胞数占总细胞数的39%.酵母细胞表面展示的BPI23具有中和内毒素的活性.结论:成功构建了pYD1-BPI600酵母表达载体,转化后在酵母细胞表面展示了功能性目的蛋白,为BPI23突变体库的建立和功能优化BPI23突变体的筛选奠定了基础.
关键词： 人杀菌通透性增强蛋白 酵母表面展示 内毒素 -
基于人DAF框架的酵母展示肽库的构建与鉴定
以hDAF cDNA为模板,用随机引物分别通过大引物PCR和交叠PCR方法引入突变,酶切后克隆到酵母表面展示载体pYD1,构建DAF-pYD1重组质粒,转化酵母细胞,PCR鉴定随机性,流式细胞仪分析DAF的表达.结果表明,随机性达到理论要求,通过流式细胞仪检测到酵母细胞表面有DAF分子的表达.以上结果表明,成功构建了基于DAF框架的酵母表面展示肽库,为进一步筛选DAF的突变体库奠定了基础.
