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目标序列捕获测序检出红细胞丙酮酸激酶缺乏症PKLR基因新的复合突变
目的:探讨红细胞丙酮酸激酶缺乏症(pyruvate kinase deficiency,PKD)的分子发病机制.方法:应用目标序列捕获和高通量二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)对临床拟诊PKD患儿的PKLR基因12个外显子及其侧翼序列进行测序,采用SIFT及PolyPhen-2数据库预测突变对蛋白质功能的影响,在确定患者致病基因型后,应用Sanger测序技术对此基因型进行验证.结果:NGS结果显示,患儿PKLR基因存在罕见的双重杂合突变:第5外显子661G＞ A(Asp221Asn)和第10外显子1528C＞ T(Arg510Ter),导致该基因的第221位氨基酸由天冬氨酸突变为天冬酰胺,第510位氨基酸由精氨酸突变为终止密码子,使PKLR基因氨基酸链编码提前终止;Sanger测序技术进一步验证了该双重突变的存在.检索相关文献及数据库显示,这两种突变在人群中的发生率极低,蛋白质功能预测均显示为有害.结论:PKLR基因661 G＞A与1528 C＞T双重杂合突变是该PKD患儿的分子发病机制,PKD患者同时存在上述复合突变的报道在国内外尚属首次.
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目标序列捕获及平行测序在临床耳聋基因诊断中的应用
目的：利用目标序列捕获（Targeted sequence capture）、生物编码（Barcode）及大规模平行测序（Massively parallel sequencing，MPS）技术，对遗传性耳聋患者进行分子病因学研究，探索低成本、多基因、多样本的耳聋基因检测在临床应用的可行性。方法利用Illumina测序平台对来自解放军总医院聋病分子诊断中心88例（来自61个家系）具有明确家族史且常见耳聋基因检测阴性的耳聋患者，以及8例阳性对照患者进行42种基因的目标序列捕获、Barcode和MPS，并对测序结果进行生物信息学分析。结果利用上述方法在88个个体中大于一人入组家系中发现了10个家系8个基因（TECTA、DFNA5、CDH23、USH1C、MYO7A、POU3F4、SLC26A4、EYA4）14个位点的致病性突变。准确验证了8个阳性对照。大于一人入组家系的致病基因检出率明显高于单人入组家系。结论高通量测序的发展为遗传性耳聋的诊断带来了巨大的机遇。目标序列捕获、Barcode、MPS的结合进一步提高了测序的准确性、降低了测序成本，同时生物信息学的进步，将促进低成本、多基因、多样本的临床耳聋基因检测成为可能。ic capture, MPS and Barcode technology will further improve the sequencing accuracy and reduce the cost. These maybe broaden the availability of clinical genetic testing for the individuals with undiagnosed deafness in the future.
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范可尼贫血FANCA基因双重杂合突变1例报告并基因突变分析
目的 报告1例疑似范可尼贫血(FA)患儿,并对其家系进行致病基因突变及表型分析以明确诊断,探讨其分子发病机制.方法 采用目标序列捕获和高通量测序方法对1例拟诊FA患儿的FANCA基因外显子及其侧翼序列进行测序,在确定息儿致病基因型后,应用Sanger测序法进行验证,同时检测患儿父母及姐姐基因型,并用Mutation Taster与PolyPhen-2软件预测突变对蛋白功能的影响.结果 先证者FANCA基因存在第14外显子c.1303C＞T(p.R435C)和第31外显子c.3031C ＞T(p.R1011C)双重杂合突变,导致该基因的第435位和1 011位氨基酸均由精氨酸变成为半胱氨酸,Sanger测序验证了该双重突变的存在.患儿父亲检出第31外显子c.3031C＞T突变,其母亲与姐姐均检出第14外显子c.1303C ＞T突变;应用上述软件预测2个突变对蛋白功能的影响均为有害.结论 报告了1例FA患儿及其家系,FANCA基因c.1303C＞T与c.3031C＞T复合突变是该FA家系的分子发病机制.
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目标序列捕获结合高通量测序在遗传性疾病的应用研究
目的 研究目标序列捕获结合高通量测序在常见遗传性疾病致病基因检测中的应用价值.方法 对217例经气相色谱-质谱联用分析技术(GC-MS)首次确诊为遗传性耳聋、甲基丙二酸血症、遗传性骨髓衰竭综合征的患儿,应用目标序列捕获结合高通量测序技术检测其相关疾病基因.结果 检测出引发患儿遗传性耳聋的致病基因为EYA4、SLC26A4、POU3F4、MYO8A、USH1C、CDH23、DFN5、TECTA,检出率为92.11％;引发甲基丙二酸血症的致病基因主要为甲基丙二酰辅酶A变位酶(MUT)、MMACHC基因突变,检出率为100％;引发患儿遗传性骨髓衰竭综合征的致病基因为SBDS、FANCD2、RPS19、FANCG、TINF2、FANCB、ELANE,检出率为100％.结论 应用目标序列捕获结合高通量测序技术对遗传性耳聋、甲基丙二酸血症、遗传性骨髓衰竭综合征的突变基因检测,结果准确,方便快捷,可在临床推广.
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一个Ⅱ型先天性红细胞生成异常性贫血家系的SEC23B基因型及表型分析
目的 对1个 Ⅱ型先天性红细胞生成异常性贫血(congenital dyserythropoietic anemia,CDA)家系进行致病基因的突变及表型分析.方法 应用目标序列捕获高通量二代测序技术对1例CDAⅡ型患者SEC23B基因的外显子及侧翼区进行测序,在确定先证者的致病基因型后,应用Sanger测序法进行验证,同时检测患者直系亲属的基因型,并用MutationTaster与PolyPhen-2软件预测突变对蛋白功能的影响,用SWISS-MODEL软件对蛋白结构进行模拟分析.结果 先证者SEC23B基因存在罕见的复合杂合错义突变c.1727 T>C(p.F576S)和c.1831C>T(p.R611W),导致该基因的第576位氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸,第611位由精氨酸变为色氨酸.Sanger测序证实了上述双重突变.先证者之姐检出c.1727T>C杂合突变,父亲及儿子均检出c.1831C>T杂合突变.此外,在先证者中检出一血色病相关基因H FE的杂合突变c.211C>T(p.R71X),导致71位的精氨酸变为终止密码子,其父亲未检出此突变.上述3种突变的蛋白功能预测均为有害,分子模拟显示其改变了SEC23B蛋白的三维构象.先证者在脾脏切除后贫血有所好转,在祛铁治疗后铁蛋白有所下降.结论 SEC23B基因c.1727T>C与c.1831C>T复合杂合突变很可能是该CDAⅡ型家系的分子发病原因,此基因型与临床表型密切相关.
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一个丙酮酸激酶缺乏症家系PKLR基因的突变分析及产前诊断
目的 对一个丙酮酸激酶缺乏症(pyruvate kinase deficiency,PKD)家系进行致病基因突变分析及产前诊断.方法 应用目标序列捕获和高通量测序技术对临床拟诊为PKD的患儿的PKLR基因外显子及其侧翼序列进行测序,采用SIFT及PolyPhen-2数据库对突变进行蛋白功能预测,在确定先证者致病基因型后,应用Sanger测序技术进行验证,同时检测其父母基因型,并对孕16周的高危胎儿抽取羊水进行产前诊断.结果 患儿PKLR基因存在罕见的双重杂合突变c.661G＞A(Asp221Asn)以及c.1528C＞T(Arg510Ter),导致该基因的第221位氨基酸由天冬氨酸变化为天冬酰胺,第510位由精氨酸改变为终止密码子.Sanger测序验证了该双重突变的存在,先证者父母分别检出c.661G＞A(Asp221Asn)与c.1528C＞T(Arg510Ter)突变.胎儿检出与先证者相同的致病突变.在终止妊娠后,对流产物进行突变位点分析,结果与产前诊断一致.结论 PKLR基因c.661G＞A与c.1528C＞T复合突变是该PKD家系的分子发病机制.通过产前诊断可以有效阻止致病基因的传递,降低生育患儿的风险.
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应用新一代测序技术进行Meckel-Gruber综合征家系突变分析研究
目的:寻找一个两次临床拟诊为Meckel-Gruber妊娠家系的致病基因突变.方法:采用目标序列捕获芯片结合高通量测序技术寻找可疑的致病基因突变位点,利用经典的Sanger测序技术进行验证.结果:发现了全世界未见报道的CEP290基因的2种新发突变.结论:新一代测序技术适用于寻找遗传异质性较强的单基因遗传病的致病基因突变位点,从而对某些表型相似的疾病进行鉴别诊断.
