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ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS信号通路可抑制异基因反应性T淋巴细胞的功能
本研究探讨ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS-B7h信号通路对异基因反应性T淋巴细胞的作用和机制.建立稳定高表达ICOS-Ig的CHO细胞株,培养制备纯化的ICOS-Ig融合蛋白;以C57BL/6小鼠脾脏来源的CIM+淋巴细胞为反应细胞,BABL/C骨髓源成熟树突状细胞为刺激细胞,应用不同浓度梯度的ICOS-Ig干预,以相同浓度的人Ig作为对照.结果显示:获得的目标蛋白的分子量为54 kD,内毒素含量<10 Eu/ml.ICOS-Ig在≥10 μg/ml时可显著减少DC刺激引起的异基因反应性T淋巴细胞的增殖效应(P<0.01).ICOS-Ig不影响T淋巴细胞的活化,ICOS-Ig浓度与CD4+T淋巴细胞的凋亡成正相关.单纯刺激组、ICOS-Ig 10 μg/ml和20μg/ml干预组的CIM+An-nexin V+PI-细胞群的频率分别为15.1%、26.4%和33.6%.ICOS-Ig作用后,Th1细胞因子TNFα分泌降低,Th2细胞因子IL-4分泌增加.结论:ICOS-Ig融合蛋白阻断ICOS通路可明显减弱异基因反应性T淋巴细胞的增殖反应,并改变Th细胞的极化,对CD4+T淋巴细胞的活化无影响,但可促进活化的T淋巴细胞凋亡.
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可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白的理化性质和体内生物学活性分析
目的 对自行研制的可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白的理化性质和体内生物学活性进行分析鉴定.方法 采用HCI水解法、Edman法、胰酶消化MALDI-TOF-MS质谱法分别测定该融合蛋白的氨基酸组成、N末端15个氨基酸序列、肽谱等理化性质,并通过CFSE标记体内检测淋巴细胞增殖反应实验研究其抑制同种淋巴细胞增殖的生物学活性.结果 氨基酸组成分析测得样品的氨基酸组成与ICOs-Ig理论值基本一致.蛋白N末端15个氨基酸序列为EINGSANYEMFIFHN,与ICOS-Ig理论值一致.MALDI-TOF-MS质谱测定共获得6个与理论预测值相符的肽段.ICOS-Ig可以明显抑制同种T细胞的体内增殖反应.结论 所研制的可诱导共刺激分子-Ig融合蛋白结构表达正确且具有体内抑制同种淋巴细胞增殖的活性,为该融合蛋白的质量标准研究奠定了基础.
关键词： ICOS-Ig融合蛋白 氨基酸组成 氨基酸序列 肽谱 淋巴细胞增殖 -
人ICOS-Ig融合蛋白的真核表达及其生物学活性
目的:真核表达人ICOS胞外区与IgG Fc融合蛋白,并对其生物学活性进行初步分析.方法:以RT-PCR方法克隆人ICOS胞外区片段和人IgG Fc片段,定向插入真核表达载体pSecTag2,构建重组质粒pSecTag2-ICOS-Ig,脂质体转染CHO细胞,可溶性表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白.采用SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA对融合蛋白进行鉴定,配体结合活性实验和混合淋巴细胞增殖反应实验检测融合蛋白的活性.结果:构建的ICOS-Ig融合蛋白表达载体在CHO细胞中表达ICOS-Ig蛋白.纯化获得的ICOS-Ig可以与配体ICOSL特异性结合,并抑制同种T淋巴细胞增殖反应.结论:成功构建了人ICOS胞外区与人IgG Fc融合蛋白真核表达系统,获得有生物学活性的ICOS-Ig融合蛋白.
关键词： ICOS-Ig融合蛋白 真核表达 配体亲和力 淋巴细胞增殖
