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犬贾第鞭毛虫PDI-4基因的表达及定位
目的 克隆、表达二硫键异构酶4基因,并研究其在犬贾第鞭毛虫滋养体中的定位. 方法 根据GenBank登陆的贾第鞭毛虫二硫键异构酶4基因(gPDI-4)(登录号XM_001710176)序列,通过分析序列,设计合成一对gPDI-4引物.以犬贾第鞭毛虫滋养体总RNA为模板,采用反转录PCR的方法扩增PDI-4基因并克隆至pMD-18 T载体,构建pMD-gPDI-4载体,再把目的基因亚克隆至pET-28a载体,构建表达载体pET-gPDI-4,转化人大肠埃希菌表达菌DE3中,经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析表达情况.同时用组氨酸(His)结合树脂柱纯化PDI-4蛋白.用纯化的PDI-4蛋白免疫小鼠,之后收集血清作为一抗,通过免疫荧光法检测PDI-4在贾第鞭毛虫滋养体中的定位. 结果 反转录PCR(RT-PCR)扩增出大小为1 065 bp的PDI-4基因,构建的pET-gPDI-4能高效表达gPDI-4蛋白,SDS-PAGE显示表达蛋白分子质量为36 ku.免疫荧光试验显示贾第鞭毛虫PDI-4蛋白除定位于细胞表面、内质网和腹部吸盘外,主要存在于腹部鞭毛. 结论 成功克隆、表达了犬贾第鞭毛虫PDI-4基因,并确定其主要在腹鞭毛表达.
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弓形虫棒状体蛋白2多克隆抗体制备纯化及其在免疫荧光定位中的运用
目的 制备弓形虫棒状体蛋白2 (ROP2)多克隆抗体并纯化. 方法 将已构建的重组质粒pET32a-ROP2转化人大肠埃希菌(E.coli) BL21 (DE3)中,用0.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白ROP2,分离上清和包涵体,包涵体洗涤后,用尿素溶解；取纯化蛋白与等体积福氏完全佐剂或不完全佐剂混合,背部皮下免疫新西兰大白兔3次,200 μg/次,3次免疫之间分别间隔14d和19d,末次免疫10d后收集兔血清,亲和纯化柱纯化,并用间接ELISA检测抗体效价,蛋白质印迹(Western blotting)分析抗体特异性.将弓形虫速殖子感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞),利用制备所得的多克隆抗体采用免疫荧光法检测ROP2在感染细胞中的定位.结果 通过诱导表达,获得重组蛋白ROP2,制备的兔源性ROP2抗体纯化后为单一蛋白抗体.间接ELISA结果显示,抗体滴度为1∶102 400; Western blotting结果显示,抗体特异性良好.同时,免疫荧光定位试验结果显示,ROP2定位在弓形虫的纳虫泡膜上. 结论 本研究制备并纯化了抗弓形虫ROP2的兔源性多克隆抗体,并成功应用于ROP2在弓形虫纳虫泡膜上的免疫荧光定位试验.
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弓形虫TgMIC16多克隆抗体制备纯化及其在亚细胞定位中的应用
目的 制备并纯化弓形虫微线蛋白16(TgMIC16)兔源多克隆抗体,并利用制备的多克隆抗体对该蛋白进行亚细胞定位.方法 利用原核表达、纯化的TgMIC16重组蛋白与等体积弗氏佐剂混合,背部皮下、多点注射免疫新西兰大白兔,于第3次加强免疫后的第14天收集兔血清,Protein A亲和纯化柱纯化,用ELISA和蛋白质印迹(Western blotting)分别检测抗体效价和抗体特异性.用弓形虫RH株速殖子感染人包皮成纤维(HFF)细胞,以制备的多克隆抗体为一抗,采用间接免疫荧光(IFA)检测TgMIC16在感染细胞中的定位.结果 间接ELISA结果显示,制备的TgMIC16多克隆抗体滴度为1:512000;Western blotting结果显示,TgMIC16抗体特异性良好;IFA结果显示,TgMIC16定位在弓形虫微线体.结论 本研究制备并纯化了抗弓形虫TgMIC16兔源多克隆抗体,并成功应用于TgMIC16在弓形虫微线体的免疫荧光定位.
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犬恶丝虫天冬氨酸转氨酶基因的原核表达及分析
目的 了解犬恶丝虫天冬氨酸转氨酶(AspAT)基因特征及其在虫体的定位,对犬恶丝虫AspAT (DiAspAT)基因进行了原核表达和免疫荧光定位分析.方法 从犬恶丝虫成虫转录组数据库中筛选到DiAspAT基因序列,通过RT-PCR方法克隆DiAspAT基因,利用相关软件进行生物信息学分析;构建原核表达载体pET32a(+)-AspAT并进行诱导表达;表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后进行Western blotting分析;通过免疫组化技术观察DiAspAT蛋白在犬恶丝虫虫体内的定位分布.结果 DiAspAT基因的ORF框长度为1 221 bp,编码406个氨基酸,理论相对分子量45.731 8 kDa,等电点为8.05,表达的重组蛋白约为64 kDa;Western blotting显示AspAT重组蛋白能被犬恶丝虫阳性血清识别;间接免疫荧光染色结果显示,DiAspAT在犬恶丝虫的侧索、皮下组织、肌细胞、假体腔壁、子宫及肠上皮、发育的胚胎中分布.结论 成功克隆和表达了DiAspAT基因,并完成DiAspAT在雌性犬恶丝虫成虫上的定位,为进一步了解犬恶丝虫的生理代谢及犬恶丝虫病的诊断和防控奠定基础.
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日本血吸虫主要虫卵抗原Sjp40在感染新西兰白兔肝脏中的表达与免疫定位
目的：观察Sjp40在感染新西兰白兔肝脏沉积虫卵及其肉芽肿病变形成中的表达情况，并进行免疫定位。方法日本血吸虫尾蚴感染新西兰白兔，收集未感染组、29 dpi组和45 dpi组肝脏，Trizol法提取各组肝脏总RNA，以日本血吸虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，Taqman探针qRT-PCR检测Sjp40 mRNA的表达；提取各组肝脏总蛋白，以硫酸铵盐析法和Protein G免疫亲和柱层析法纯化的抗Sjp40-McAb 9G7和抗弓形虫tSAG1-McAb Y3A8（对照抗体），western blot检测Sjp40蛋白的表达；制备肝脏石蜡切片，HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿的形成与发展，进一步以免疫荧光技术进行Sjp40在肝脏沉积虫卵及其肉芽肿组织中的定位。结果日本血吸虫感染兔呈急性肝肉芽肿病变期的45 dpi肝脏沉积虫卵中Sjp40 mRNA水平显著高于29 dpi尚未形成虫卵肉芽肿结节的肝脏沉积的未成熟虫卵（P<0.05），westernb blot证实了Sjp40蛋白在29 dpi和45 dpi兔肝脏中的表达。免疫荧光显示：Sjp40在29 dpi兔肝脏中定位于未成熟虫卵内，而45 dpi可见感染兔肝脏中沉积大量成簇内含毛蚴的成熟虫卵及其周围肉芽肿组织均有明显荧光。结论 Sjp40在日本血吸虫感染兔肝脏沉积虫卵中的转录水平随虫卵发育成熟而显著增加，在感染兔急性肉芽肿病变期（45dpi）呈现由虫卵向其周围肉芽肿组织扩散现象，提示该分子在血吸虫肉芽肿形成与发展过程中具有重要作用。
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树突状细胞研究中激光扫描共聚焦显微镜的应用进展
免疫应答是机体重要的防御功能,抗原呈递细胞(Antigen presenting cells, APC)是启动特异性免疫应答的关键.树突状细胞(Dendritic cells, DC)是体内强的一类APC,参与免疫应答的双重调控作用.激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope, LSCM)由于具有高分辨率、高灵敏度、"光学切片"、三维重建、动态分析等特点,为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段,使DC的研究更加细致和深入.本文就LSCM在DC的形态学、免疫荧光定位、功能学方面的应用新进展作一综述.
关键词： 树突状细胞 激光扫描共聚焦显微镜 免疫荧光定位 抗原呈递
