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曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶(SmLAP)的生物信息学分析、克隆及表达
目的 利用生物信息学方法分析曼氏迭宫绦虫亮氨酸氨基肽酶(SmLAP)基因的结构和功能,并将该基因克隆至原核表达载体在大肠埃希菌中进行原核表达并纯化,为进一步研究其功能奠定基础. 方法 利用生物信息学相关软件,分析SmLAP基因及其编码蛋白的结构、生物学和免疫学功能特征.通过PCR扩增得到目的基因,克隆至原核表达载体pGEX-4T1中,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组蛋白利用GST标签层析柱纯化,采用12％ SDS-PAGE分析蛋白纯度. 结果 曼氏迭宫绦虫LAP基因ORF finder显示核酸序列为1 662 bp,编码554个氨基酸,预测在第21个氨基酸的位置出现信号肽.切除信号肽后的核酸序列为1 083 bp,编码360个氨基酸,理论分子质量单位为40 ku,与人LAP基因序列相似性为38％.将SmLAP和人B细胞抗原表位预测结果比对,相似度极低.构建的原核表达载体pGEX-4T1-SmLAP转化人大肠埃希菌后用IPTG进行诱导表达,目的蛋白主要以包涵体的形式存在.通过超声破碎、尿素溶解包涵体、透析、GST层析柱后获得单一组分的重组蛋白. 结论 构建的原核表达系统能表达SmLAP蛋白.生物信息学分析SmLAP是一个有潜在应用价值的免疫诊断分子,且主要以包涵体形式存在.
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曼氏迭宫绦虫中亮氨酸氨基肽酶基因的生物信息学分析和转录水平检测
目的 检测曼氏迭宫绦虫的3个亮氨酸氨基肽酶亚类(leucine aminopeptidases of Spirometra mansoni,SmLAPs)基因在虫体不同发育阶段的转录水平,为进一步病原诊断研究奠定基础.方法 运用生物信息学相关软件对3个亮氨酸氨基肽酶亚类编码蛋白的氨基酸序列的功能区域、免疫学特征、信号肽和跨膜区预测分析.应用Real time PCR方法检测SmLAPs在曼氏迭宫绦虫的成节、孕节和裂头蚴阶段的转录水平. 结果 对SmLAPs编码氨基酸序列的保守区域进行比对,SmLAPa与SmLAPb、SmLAPc的氨基酸序列一致性均为38％,SmLAPb和SmLAPc的一致性也只有44％.多功能位点分析发现,SmLAPs均含有底物结合位点、锌离子结合位点和多肽结合位点.在B细胞线性表位预测结果显示,SmLAPa有13个、SmLAPb有14个、SmLAPc有13个.T细胞表位预测中,SmLAPa有12个、SmLAPb有13个、SmLAPc有14个.3个SmLAPs亚类序列中均含有一个强烈的信号肽,并且均没有跨膜区域.在虫体各个发育阶段的转录水平检测中,在成节阶段,SmLAPb的转录水平是SmLAPa的1.34倍,SmLAPc的转录水平是SmLAPa的46.53倍.在孕节阶段,SmLAPb的转录水平是SmLAPa的1.96倍,SmLAPc的转录水平是SmLAPa的56.89倍.在裂头蚴阶段,只有SmLAPc有转录,没有检测到SmLAPa和SmLAPb的转录. 结论 在3个SmLAPs亚类基因中,SmLAPc是裂头蚴病更有价值的免疫诊断分子.
