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马疱疹病毒1型(EHV-1)gC蛋白的原核表达及其免疫原性分析
目的 马鼻肺炎由马疱疹病毒1型(EHV-1)和4型(EHV-4)引起,但是二者存在广泛的抗原交叉反应,给两型病毒感染的鉴别诊断带来困难.EHV-1 gC糖蛋白(gC1)具有凝集马红细胞的功能,而EHV-4 gC糖蛋白不具有此特性,因此获得纯化的gC蛋白有助于建立马鼻肺炎鉴别诊断方法以及进一步研究马疱疹病毒感染的免疫分子机制.方法 提取病毒基因组DNA,用特异性引物对目的基因片段进行扩增,对正确扩增的基因片段以及克隆载体pET30a(+)分别进行BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,将所得目的基因片段插入表达载体pET30a(+)中,构建重组质粒pET30a-gC1.经双酶切和序列鉴定为阳性的重组质粒pET30a-gC1转化入大肠埃希菌表达菌株Rosseta中,经IPTG诱导表达目的蛋白并对表达条件进行优化,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 重组质粒转化菌经IPTG诱导表达60 ku的目的蛋白,大小与预期相符,且在诱导温度为25℃时蛋白呈可溶性表达,诱导温度为30℃时蛋白以包涵体的形式表达.将包涵体电泳后切胶纯化回收,纯化效率相对较好,纯度较高.Western blot检测目的蛋白能被EHV-1和EHV-2感染马血清识别.结论 成功构建EHV-1 gC基因表达载体,其表达产物具有反应原性,为进一步开展EHV感染的分子诊断奠定了基础.
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人白细胞介素-22的克隆及原核表达
目的 克隆hIL-22成熟链基因并在大肠杆菌表达体系中进行有效表达.方法 采用反转录PCR以及巢式PCR的方法克隆得到hIL-22基因.将hIL-22基因装入PQE3.0载体构建重组载体hIL-22/PQE3.0,继而转化宿主工程菌株M15.经异丙基B-D硫代半乳糖苷诱导表达产生hIL-22/His重组蛋白并纯化.重组蛋白经电泳分析和Western blot验证.结果 成功地克隆和构建了hIL-22/PQE3.0载体,转化的工程菌经过诱导表达18kd的hIL-22成熟链,利用亲和层析得到了纯化的重组蛋白.结论 成功获得hIL-22/His重组蛋白,为下一步研究人IL-22在肿瘤细胞中的作用奠定了物质基础.
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CD26多克隆抗体的制备与鉴定
出PET32a/CD26原核表达质粒,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达,经his亲合层析纯化后蛋白量达2.3 mg/ml,制备的多抗血清纯化后效价达256 000,经Western-blot证明能特异性的识别CD26重组蛋白,免疫细胞化学染色显示能特异的结合于H9细胞.结论 成功制备了能特异性识别CD26的多克隆抗体.
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HPV58型E2蛋白表达纯化与多克隆抗体制备
目的:表达纯化重组人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E2蛋白,制备多克隆抗体.方法:构建重组质粒pET-28b-E2,转化至BL21(DE3)pLysS中诱导表达,包涵体洗涤后经镍柱亲和层析分离得到纯化目的蛋白.用纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗HPV58型E2蛋白多克隆抗体,ELISA分析多克隆抗体的效价,免疫印迹检测抗体的特异性.结果:表达纯化了重组HPV58型E2蛋白,制备了高滴度和高特异性的多克隆抗体.结论:制备的多克隆抗体可用于对HPV58型E2蛋白进行精细B细胞线性表位鉴定.
关键词： HPV58型E2蛋白 蛋白表达 包涵体纯化 抗体制备 -
HPV58型E1重组蛋白的表达纯化及其多克隆抗体的制备
目的:原核表达重组人类乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E1蛋白,并制备兔抗HPV58型E1蛋白多克隆抗体.方法:分别构建含编码E1蛋白分子中1～326 aa(E1-N)的cDNA片段的表达质粒pET-28b-E1-N,以及含编码E1蛋白分子中319～644 aa(E1-C)cDNA片段的表达质粒pET-28b-E1-C原核表达载体,分别转化感受态BL21(DE3)细胞,经诱导表达后,利用镍柱亲和层析方法,分离纯化目的蛋白E1-N和E1-C作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备抗E1多克隆抗体,Western blotting检测抗体的特异性.结果:制备获得高纯度的E1-N和E1-C蛋白,以及高滴度的兔抗E1多克隆抗体,Western blotting结果示,制备的多克隆抗体具有较好的抗原特异性.结论:成功获得兔抗HPV58型E1蛋白多克隆抗体,为E1蛋白分子中线性B细胞表位的鉴定提供了物质基础.
关键词： HPV58型E1重组蛋白 蛋白表达 包涵体纯化 抗体制备 -
HPV58型E1^E4蛋白的表达纯化和多克隆抗体的制备
目的:构建pRSET-AkE1^E4原核表达载体,获得E1^E4蛋白的多克隆抗体.方法:在BL21(DE3)细胞中诱导E1^E4融合蛋白表达,收集包涵体经过镍柱纯化后免疫新西兰白兔,获得的抗血清经硫酸铵沉淀法纯化得到抗体.结果:经Western blotting检测表明制备的E1^E4蛋白多克隆抗体特异性较好.结论:成功获得了纯化的E1^E4蛋白抗体,有助于后续HPV58型E1^E4蛋白功能和B细胞抗原表位的研究.
