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Veliparib联合青蒿琥酯体外抗细粒棘球蚴作用机制的研究
目的 观察DNA损伤修复抑制剂Veliparib联合青蒿琥酯体外对细粒棘球蚴活性的影响, 分析Veliparib联合青蒿琥酯抗囊型包虫病的作用机制.方法 将细粒棘球蚴分为空白组, DMSO组, Veliparib (10μmol/L) 组, 硝唑尼特 (nitazoxanide, NTZ) 组, H2O2组, 青蒿琥酯低 (65μmol/L) 、中 (130μmol/L) 、高 (325μmol/L) 剂量组, H2O2+Veliparib组, 青蒿琥酯低剂量+Veliparib组, 青蒿琥酯中剂量+Veliparib组、青蒿琥酯高剂量+Veliparib组, 共12组.采用1％伊红染色法检测药物干预2、3、4d细粒棘球蚴的活性, 计算虫体死亡率.给药组干预细粒棘球蚴4d后, 观察虫体组织病理学和超微结构变化;通过彗星试验评价DNA损伤情况;采用免疫荧光法观察虫体内DNA损伤标志物8-羟基脱氧鸟苷 (8-oxo-dG) 的变化.结果 与DMSO组和青蒿琥酯各剂量组相比, 青蒿琥酯低、中、高剂量联合Veliparib组细粒棘球蚴死亡率均显著升高 (P<0.01);组织病理学观察青蒿琥酯各剂量联合Veliparib组细粒棘球蚴虫体损坏情况较青蒿琥酯各剂量组严重且明显固缩, 着色加深, 并有空泡形成;超微结构观察青蒿琥酯各剂量联合Veliparib组的细粒棘球蚴合胞体带混沌, 细胞结构破坏, 异染色质边际化, 出现脂滴、空泡样结构, 微绒毛明显破坏或减少;彗星试验显示青蒿琥酯各剂量联合Veliparib组细粒棘球蚴彗星拖尾较低、中、高青蒿琥酯组明显加长, Olive尾矩 (OTM) 值差异均有统计学意义 (t值分别为5.358, 2.482和4.224, P<0.05) .免疫荧光显示青蒿琥酯高剂量+Veliparib组8-oxo-dG的阳性核数较青蒿琥酯高剂量组增多.结论 DNA损伤修复抑制剂Veliparib增强青蒿琥酯抗囊型包虫病作用, 其作用机制是使虫体的DNA损伤更严重, 从而导致棘球蚴死亡, 为开发新的抗包虫病药物奠定了理论基础.
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X射线照射联合Veliparib诱导小鼠乳腺癌细胞衰老的相关研究
目的 电离辐射联合多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)抑制剂能够加速肿瘤细胞衰老,衰老的肿瘤细胞分泌水平会发生变化.本研究探讨X射线照射联合Veliparib诱导小鼠乳腺癌细胞衰老及其衰老相关分泌表型(senescenceassociated secretory phenotype,SASP)的变化.方法 采用X射线照射联合Veliparib处理小鼠乳腺癌细胞株4T1,诱导衰老肿瘤细胞模型;采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒检测细胞SA-β-gal作为评估衰老的指征,根据细胞大小及颗粒流式分选大衰老肿瘤细胞;荧光定量PCR检测衰老相关分泌表型,比较对照组、Vel组、X射线组、X射线+ Vel组的相对表达量,观察X射线+Vel组细胞因子表达的动态变化;采用多重液相蛋白定量技术(cytometric beads array,CBA)检测细胞上清液中TNF-α、IFN-β和IFN-γ的浓度;荧光定量PCR检测流式分选出的大衰老细胞和非衰老细胞的分泌表型.结果 X射线+Vel组细胞在照射后第4天出现明显的衰老指征;对照组、Vel组、X射线组、X射线+Vel组中大衰老肿瘤细胞的比例分别为(2.633±0.961)％、(2.867±1.069)％、(20.133±3.570)％和(58.200±6.583)％,析因设计方差分析显示X射线照射(F=273.720,P＜0.001)及药物Veliparib(F=75.691,P＜0.001)的主效应差异均有统计学意义,X射线照射与药物Veliparib的交互效应显著(F=73.858,P＜0.001);X射线+Vel组大衰老细胞比例明显高于对照组(t=14.468,P＜0.001)、Vel组(t=14.371,P＜0.001)及X射线组(t=8.805,P=0.001).在SASP mRNA相对表达量方面,X射线及Veliparib的主效应与两者的交互效应均有统计学意义,X射线+Vel组p21、IFN-β、TNF-α、CCL5、CXCL9和CXCL10 mRNA的相对表达量高,与对照组、Vel组、X射线组相比,差异均具有统计学意义,均P＜0.001;各细胞因子在联合处理后第4天出现表达高峰,随后下降;X射线+Vel组细胞上清液中TNF-α、IFN-β、IFN-γ的浓度高,X射线+Vel组均明显高于对照组(P＜0.001)与X射线组,P＜0.001;流式分选出的衰老细胞较非衰老细胞p21、SASP表达水平更高,差异具有统计学意义,均P＜0.05.结论 X射线照射联合veliparib诱导4T1细胞衰老并导致其分泌表型发生明显变化,主要表现为免疫刺激的正向作用.
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新型PARP抑制剂veliparib
肿瘤细胞能够激活自身DNA的损伤修复机制进行修复,从而导致其对抗肿瘤药物和放疗产生耐药性,而聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)是一种DNA修复酶,在DNA修复通路中起关键作用.veliparib 是一种新型高选择抑制PARP的苯并咪唑类化合物,体内外实验表明本品具有显著的抑制PARP活性的作用.在治疗转移性乳腺癌、结肠癌、转移性黑色素瘤和脑肿瘤方面已取得显著的效果,其与替莫唑胺联用治疗乳腺癌的研究即将进入Ⅲ期临床.
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PARP抑制剂veliparib的合成工艺改进
目的 设计合成PARP抑制剂veliparib,并对其合成工艺进行优化.方法 以(R)-吡咯烷-2-羧酸为起始原料,经过环合、甲基化、开环、N-H保护、水解、酸氨缩合、咪唑合环、脱保护和成盐酸盐等步骤不对称合成目标化合物veliparib.结果 设计的合成路线与文献不同,目标化合物veliparib的合成总收率为9.48％,目标化合物和中间体的结构经1 H-NMR和GC-MS确证.结论 设计了全新的合成路线,该路线具有原料易得、价格低廉、操作简便、安全等优点,避免了使用手性柱分离目标化合物,适合于工业化生产.
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sPD-1过表达增强衰老肿瘤细胞疫苗抗小鼠乳腺癌作用
目的 探讨可溶性PD-1(sPD-1)过表达后对衰老肿瘤细胞疫苗(STCV)抗小鼠乳腺癌的增强作用.方法 干扰素γ(IFN-γ)刺激小鼠乳腺癌细胞4T1,流式细胞术检测PD-L1表达;sPD-1过表达慢病毒感染4T1,显微镜观察增强绿色荧光蛋白表达情况;CCK8实验比较4T1、4T1/sPD-1增殖活力;qRT-PCR、Western blot从mRNA、蛋白质水平验证sPD-1表达;干扰素γ预处理4T1细胞,添加4T1/sPD-1培养上清,孵育后流式细胞术检测PD-1阳性细胞比例;X射线照射联合Veliparib处理4T1、4T1/sPD-1细胞,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色,观察蓝染细胞比例;Balb/c小鼠右后腿皮下种植4T1,左后腿注射PBS、4T1 STCV、4T1/sPD-1 STCV,观察各组小鼠成瘤率.结果 IFN-γ能导致4T1细胞PD-L1上调(P<0.001),且浓度越高,PD-L1表达上调越明显,高达(84.80±1.03)％;病毒感染4T1细胞后,显微镜下可见绿色荧光;CCK8实验中4T1、4T1/sPD-1细胞增殖曲线无明显差异(P>0.05);4T1/sPD-1细胞在mRNA和蛋白质上均可检测到sPD-1表达产物,4T1细胞则均未能检测到;干扰素γ预处理的4T1细胞,PD-1阳性比例(6.893±0.271)％,添加4T1/sPD-1细胞培养液处理后,PD-1阳性细胞比例升高达(55.450±0.555)％(P<0.001);4T1、4T1/sPD-1在联合处理后,镜下见大量蓝染变形的衰老细胞;小鼠荷瘤实验中,预防肿瘤发生实验,PBS组所有小鼠出现肿瘤生长,4T1 STCV组有28.787％小鼠未发生肿瘤,4T1/sPD-1 STCV组近55.556％小鼠未发现肿瘤发生;治疗肿瘤实验中,观察期内PBS组小鼠均发生肿瘤,4T1 STCV、4T1/sPD-1 STCV组无瘤小鼠比例分别为11.111％和38.89％.结论 衰老肿瘤细胞疫苗对小鼠乳腺癌具有防治作用,且sPD-1过表达后能够增强衰老肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤作用.
