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人SREBP-1c启动子报告基因的构建和功能验证
目的 构建人SREBP-1c启动子的荧光素酶报告基因载体并进行功能的初步验证.方法 提取人血基因组DNA,PCR扩增SREBP-1c的启动子,构建SREBP-1c启动子双荧光素酶的报告基因载体;用双荧光素酶活性检测其功能.Western blot检测FoxO1对SREBP-1c蛋白的抑制作用.结果 成功构建了pGL3-Basic-SREBP-1c-promoter的报告基因载体,共转染FoxO1明显抑制了人SREBP-1c启动子的活性,同时过表达FoxO1抑制了SREBP-1c的蛋白表达.结论 FoxO1通过抑制SREBP-1c的转录来抑制SREBP-1c的表达.
关键词： SREBP-1c启动子 FoxO1 双荧光素酶报告基因分析 -
miRNA-181b在氧-糖剥夺致N2A细胞缺血损伤中的作用及对热休克蛋白A5表达的调节
目的 探讨miR-181b在氧糖剥夺(OGD)致N2As神经瘤细胞缺血损伤中的作用,及其对热休克蛋白(HSP)A5表达的调节.方法 应用N2A细胞OGD模型模拟神经细胞缺血损伤,MTT比色法检测N2A细胞生存率,免疫印迹法检测HSPA5蛋白表达水平,实时定量PCR法检测miR-181b和HSPA5 mRNA表达水平,荧光素酶报告基因技术检测miR-181b对HSPA5 mRNA的直接调控作用.结果 miR-181b在OGD致N2A细胞缺血损伤中表达水平明显降低(n=5);在OGD致N2A细胞缺血损伤过程中,通过上调或抑制miR-181b的表达水平可以显著影响N2A细胞的生存率(n=6);而在非OGD条件下,miR-181b表达水平的改变对N2A细胞活力无影响;miR-181b表达水平的改变可显著影响HSPA5蛋白表达水平(n=3),而非HSPA5的mRNA水平;共转染miR-181b前体(premiR-181b)或miR-181b抑制剂(anti-miR-181b)可显著抑制或增高含有HSPA5 mRNA 3’-UTR的荧光素酶报告基因的活性(n=5).结论 miR-181b通过负性调节HSPA5的蛋白表达水平,在OGD致N2A神经细胞缺血性损伤中发挥重要作用.
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miR-205对PEG3在子宫内膜癌细胞系中的靶向降调作用
目的 探讨子宫内膜癌细胞系中miR-205对父性表达基因3(PEG3)蛋白的作用.方法 免疫组化方法确定PEG3蛋白在正常子宫内膜与高、中、低分化子宫内膜癌组织中表达的差异.RT-PCR筛选出miR-205较正常子宫内膜细胞株表达量高的高、中、低分化子宫内膜癌细胞系,CCK-8及流式细胞学实验检测上调miR-205前后细胞增殖及凋亡；Western blot、RT-PCR和双荧光素酶报告基因分析等实验方法验证miR-205对PEG3是否有直接的靶抑制作用.结果 PEG3蛋白在正常子宫内膜组织中表达明显高于高、中、低分化子宫内膜癌组织.miR-205在高、中、低分化子宫内膜癌细胞系中上调后,细胞增殖促进,凋亡抑制；Western blot结果示PEG3蛋白含量降低,PEG3抑制的WNT通路中的两个关键蛋白β-catenin及c-myc也相应的表达量上调,而RT-PCR结果显示PEG3mRNA含量变化差异无统计学意义；双荧光素酶报告基因分析结果显示miR-205作用于PEG3基因的3'UTR端.结论 MiR-205作用于PEG3基因的3'UTR端,在转录后水平抑制PEG3的表达,提示PEG3是miR-205的直接靶基因.
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ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5'侧翼区序列转录活性的鉴定
目的 检测ezrin基因在几种癌细胞中的表达及其5'侧翼区序列的转录活力,探讨ezrin基因在癌细胞的表达调控机制.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot法检测ezrin基因在食管癌细胞EC109、EC171、EC8712、SHEEC,胃癌细胞N87、BGC823,肺癌细胞A549、95D,肝癌细胞HepG2,白血病细胞K562和宫颈癌细胞HeLa中的mRNA和蛋白表达水平;采用PCR法构建以ezrin基因翻译起始位点上游-1444/+134序列为启动子的真核细胞表达质粒pGLB-hE(-1444/+134);采用双荧光素酶报告基因分析系统检测-1444/+134序列在EC109、Hela、A549和BGC823细胞中的转录活力.结果 ezrin基因在食管癌等几种癌细胞中均有高表达,其5'侧翼区-1444/+134序列具有较强的转录活力.结论 ezrin基因5'侧翼区序列的转录活性可能对ezrin基因的几种癌细胞中的高表达起重要作用.
