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以肿瘤抗原BAP31为靶点的基因疫苗构建及其诱导小鼠免疫反应的研究
目的: 构建重组表达载体P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗并接种小鼠, 评价其诱导的体液和细胞免疫应答.方法: 利用分子克隆技术, 构建重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31, 同时构建P-BAP31/EGFP和P-L-BAP31/EGFP重组质粒, 并将其以脂质体瞬时转染HeLa细胞, 通过荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31免疫C57BL/6小鼠, 采用间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;通过酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测免疫脾细胞在受到BAP31抗原刺激后产生IFN-γ和IL-4细胞因子的频率;通过乳酸脱氢酶(LDH释放)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答.结果: 酶切及测序结果表明, 成功构建了针对BAP31肿瘤抗原的P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗.通过荧光显微镜观察重组质粒转染的HeLa细胞, 可见EGFP报告基因表达的绿色荧光.ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价发现, 带LAMP组明显高于不带LAMP组(P<0.05), 且两者均高于空质粒(P-LAMP)及正常对照(N)组(P<0.01).ELISPOT检测脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率, 带LAMP组与其他组相比显著提高(P<0.01).LDH释放试验显示, 带LAMP组的特异性CTL活性高于不带LAMP组, 且均高于对照组(P<0.01).结论: 构建了针对肿瘤抗原BAP31的全长基因疫苗, 以其免疫C57BL/6小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫反应, 其中, P-L-BAP31基因疫苗各项免疫反应均优于P-BAP31.
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截短型肿瘤抗原BAP31 DNA疫苗的构建及免疫效果分析
目的:通过LAMP分子的靶向作用,增强截短型BAP31肿瘤抗原(BAP31)的MHC-Ⅱ提呈,激活更多的特异性CD44T细胞,终辅助增加CTL细胞的杀伤活性及特异性抗体产生.方法:构建重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31,同时构建重组质粒P-△AP31/EGFP和P-L-△AP31/EGFP.质粒P-△AP31/EGFP和P-L-△AP31/EGFP瞬时转染Hela细胞,荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;ELISPOT检测免疫脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率;乳酸脱氢酶释放法检测免疫小鼠特异性CTL反应.结果:经酶切鉴定及序列测定,成功构建截短型肿瘤抗原BAP31的DNA疫苗重组载体;用带EGFP报告基因的重组质粒转染Hela细胞,荧光显微镜观察可见特异性的绿色荧光;ELISA检测免疫小鼠血清,带LAMP组BAP31特异性抗体效价明显高于不带LAMP组(P<0.01),且两者均高于空质粒及正常对照组;ELISPOT检测分泌IFN-γ,IL-4的T细胞频率,带LAMP组明显增高(P<0.01);杀伤试验表明,特异性CTL活性带LAMP组较不带LAMP组显著提高,且均高于对照组(P<0.01).结论:构建的P-△AP31和P-L-△AP31基因疫苗不仅在小鼠体内均可诱导特异性体液和细胞免疫应答,而且P-L-△AP31基因疫苗的免疫效果显著优于P-△AP31,为进一步研制肿瘤治疗性基因疫苗奠定了基础.
