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人羊膜间充质干细胞来源的雪旺细胞样细胞移植在皮瓣神经再生中的作用
目的 通过将人羊膜间充质干细胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,hAMSCs)在体外诱导分化为雪旺细胞样细胞(Schwann cells-like cells,SCs-like cells),分别观察两种细胞移植对皮瓣神经再生的作用.方法 采用胰蛋白酶/胶原酶二步消化法分离提取hAMSCs并传代,流式细胞术和免疫荧光法鉴定hAMSCs.取第3代培养6d的hAMSCs体外诱导分化为SCs-like cells,诱导分化19d后,分别采用免疫荧光法、Western blot及实时荧光定量PCR (real time fluorescent quantitative PCR,qPCR)检测SCs-like cells和第3代培养6d的hAMSCs中S-100、p75和神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达;ELISA检测第3代培养6d的hAMSCs以及加入诱导液1、2、3诱导后19d内上清液中BDNF和NGF表达量.另取SD雌性大鼠75只,建立大鼠腹壁失神经支配穿支皮瓣模型,分为3组(n=25),A、B、C组分别于大鼠皮瓣标记处皮下多点注射培养6d处于增殖期的第3代hAMSCs 1×106个、SCs-like cells 1×106个和等体积PBS,分别于移植后2、5、7、9、14d采用免疫荧光法观察神经丝重链多肽抗体(neurofilament heavy polypeptide antibody,NF-01)阳性表达的神经再生情况.结果 经流式细胞术和免疫荧光法鉴定提示培养的细胞为hAMSCs.免疫荧光法、Western blot及qPCR检测结果显示,SCs-like cells的S-100、p75和GFAP阳性细胞百分比、蛋白表达量及基因相对表达量均明显高于hAMSCs,差异均有统计学意义(P＜0.05).ELISA检测示:第3代培养6d的hAMSCs中加入诱导液1后,BDNF和NGF表达量明显降低,随着诱导液2及诱导液3的依次添加,BDNF和NGF表达量逐渐升高,且浓度明显高于第3代培养6d的hAMSCs,各时间点间差异均有统计学意义(P＜0.05).免疫荧光法观察示,移植后5～14dB组再生神经纤维数高于A组和C组.结论 hAMSCs在体外经适当的化学因子调节后可诱导分化为SCs-like cells,在诱导分化过程中释放了大量促进神经生长的因子;且SCs-like cells移植后通过释放大量BDNF和NGF,在神经再生数量方面高于hAMSCs移植.
