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G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1对BMSCs向内皮细胞分化的影响机制研究
目的 通过比较G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1 (G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)野生型及GIT1基因敲除型小鼠BMSCs向内皮细胞分化过程,探讨GIT1影响血管形成的机制.方法 GIT1杂合子小鼠雌雄配对饲养,对获得的新生小鼠采用PCR法行基因型鉴定.取GIT1野生型与GIT1基因敲除型小鼠胫骨及股骨,分离培养BMSCs并传代.取第2代BMSCs分为4组,分别为野生型对照组(A组)、野生型实验组(A1组)、基因敲除型对照组(B组)、基因敲除型实验组(B1组);A1、B1组细胞采用内皮细胞诱导液培养,A、B组细胞进行常规培养.Western blot检测各组细胞VEGF受体2(VEGF receptor 2,VEGFR-2)、VEGFR-3、磷酸化VEGFR-2 (phospho-VEGFR-2,pVEGFR-2)、pVEGFR-3蛋白表达;流式细胞仪检测各组内皮细胞标志物血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、血小板内皮细胞黏附因子1(platelet-endothelial celladhesion molecule 1,PECAM-1)、血管内皮黏钙蛋白(vascular endothelial cadherin,VE-Cadherin)表达.另取GIT1野生型小鼠第2代BMSCs分为4组:Ⅰ组,原细胞培养液培养;Ⅱ组,细胞培养液中加入VEGFR-3阻断剂SAR131675;Ⅲ组,内皮细胞诱导液培养;Ⅳ组,内皮细胞诱导液中加入SAR131675.流式细胞仪检测各组内皮细胞标志物vWF、PECAM-1、VE-Cadherin表达.结果 Western blot检测示,A、A1、B、B1组细胞的VEGFR-2、pVEGFR-2蛋白表达无明显差异,A1组VEGFR-3、pVEGFR-3蛋白表达明显高于其余3组.流式细胞仪检测示,A1组vWF、PECAM-1及VE-Cadherin表达均显著高于A、B、B1组,B1组显著高于A、B组(P＜0.05);A、B组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).阻断VEGFR-3实验中,Ⅲ组vWF、PECAM-1及VE-Cadherin表达均显著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组,Ⅳ组高于Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.05);Ⅰ、Ⅱ组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 GIT1通过VEGFR-3影响小鼠BMSCs向内皮细胞分化,进而影响血管形成.
关键词： G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1 BMSCs 内皮细胞 VEGF受体3 小鼠
