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单纯疱疹Ⅱ型病毒UL29基因shRNA表达载体的干扰效应
目的：应用RNA干扰技术，针对单纯疱疹Ⅱ型病毒（HSV-2）UL29基因构建短发夹RNA重组表达载体，观察其对HSV-2的干扰效应。方法：针对HSV-2 UL29基因筛选出4条拟干扰靶位点序列，分别设计、合成4组靶向UL29基因shRNA的基因真核表达载体。通过脂质体转染到HEK293细胞。再将HSV-2接种到HEK293细胞中。采用终点滴定法检测病毒滴度，RT-PCR检测shRNA对转录水平的影响，Western-blot检测shRNA对蛋白质表达水平的影响。结果：终点滴定法结果显示UL29shRNA各组均可不同程度降低病毒感染滴度，与空白组（未转染重组表达载体）比较差异显著（P＜0．01）。RT-PCR结果显示，与空白组比较，4组抑制率分别为28．80％、59．95％、66．08％、36．27％，差异均具有显著性（P＜0．05），shRNANC（不针对任何基因的序列）与空白组相比差异无显著性，其中以UL29shRNA1461组效果为佳。 Western-blot检测表明UL29shRNA各组ICP8蛋白表达水平比阴性对照组明显降低。结论：UL29shRNA能有效干扰HSV-2UL29基因的表达，抑制HSV-2在HEK293细胞中的复制。
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UL54和UL29基因干扰对HSV-2复制的影响
目的 利用RNAi技术同时沉默Ⅱ型单纯疱疹病毒的UL54和UL29基因,探讨双基因干扰对HSV-2复制的影响.方法 采用pGPU6/GFP/Neo质粒分别构建UL54、UL29基因的shRNA重组表达质粒,单独或同时转染HEK293细胞,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹方法检测UL54、UL29基因的表达,终点滴定法检测培养细胞上清液中病毒感染滴度;MTT法测定细胞的存活效率.结果 转染后48h后,与空白组相比,各干扰组均可不同程度降低上清液中的病毒滴度,提高细胞存活率,降低目的基因mRNA和蛋白的表达(P＜0.01).与单干扰组相比,双基因干扰组能更有效降低病毒滴度并提高细胞存活率(P＜0.01),增加了对UL54和UL29基因mRNA的抑制率,降低了蛋白的表达(P＜0.01).结论 pG-PU6/GFP/Neo-UL54、pGPU6/GFP/Neo-UL29重组表达质粒同时转染细胞可抑制HSV-2的复制,采用双基因干扰比单独基因干扰具有更高的效率.
